Une unité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour ligaturer 50 % des fragments HindIII de l'ADN λ (concentration des terminaisons 5' de l'ADN de 0,12μM, 300μg/ml) dans un volume de réaction total de 20μl en 30 minutes à 16℃.
Application：
Ligature d'ADNd avec des extrémités collantes ; réparation de l'ADNd par coupure ; clonage après la synthèse de l'ADNc de second brin [2] .
Source：
ADN ligase recombinante exprimée dans E. coli.
Tampon de stockage de l'enzyme：
10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0,1mM EDTA, 200µg/ml BSA, 50% Glycérol (pH7,4, 25℃).
Inactivation ou inhibition：
L'ADN ligase d'E. coli peut être inactivée par incubation à 65℃ pendant 20 minutes.
Précautions：
L'efficacité de ligature de ce produit pour les fragments à extrémité émoussée est extrêmement faible. Utiliser la T4 DNA Ligase pour la ligature de l'extrémité émoussée.Ce produit ne peut pas être utilisé pour la ligature de l'ADN ss ou de l'ARN.Ce kit est destiné à la R&D uniquement. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.
Instructions pour l'utilisation：
1. Préparer la réaction sur de la glace comme suit:RéactifVolumeConcentrations finalesdDNAxμljusqu'à 0,25μg/μl10X Tampon de réaction2μl1XE. coli DNA Ligase (10U/μl)1μl0,5U/μlEau sans nucléase(17-x)μl-Volume total20μl-Note 1 : Lorsque plusieurs réactions sont nécessaires, préparer un mélange maître comprenant tous les réactifs à l'exception de l'ADN substrat, puis le distribuer dans différents tubes PCR sans nucléase. Note 2 : E. coli DNA Ligase doit être conservé sur de la glace pendant l'expérience.2. Bien mélanger à l'aide d'une pipette ou d'un vortex. Centrifuger brièvement pour recueillir le liquide au fond du tube PCR.3. Incuber à 16℃ pendant 30-60 minutes.4. Après incubation, inactiver immédiatement la réaction par la chaleur à 65℃ pendant 20 minutes.5. Examiner les produits de la réaction par électrophorèse sur gel d'agarose ou sur gel de polypropylène. Si l'ADN doit être récupéré du gel d'agarose, nous recommandons d'utiliser le kit d'extraction de gel d'ADN . Pour purifier l'ADN des réactions de digestion enzymatique, nous recommandons d'utiliser le kit de nettoyage PCR/kit de purification de l'ADN .6. Pour d'autres applications, veuillez vous référer à la littérature relative à l'E. coli DNA Ligase.FAQ:1. Quelle est la différence entre l'ADN ligase E. coli et l'ADN ligase T4 ? Dans les conditions recommandées dans le manuel, l'ADN ligase E. coli ne peut pas ligaturer des molécules d'ADN ou d'ARN à extrémité émoussée [3].2. L'ADN ligase d'E. coli peut-elle être inactivée par la chaleur ? L'ADN ligase d'E. coli peut être inactivée par incubation à 65℃ pendant 20 minutes.3. Comment choisir la ligase ou le kit de ligature approprié ? Pour la ligature rapide de fragments d'ADN à extrémité émoussée ou collante, le kit de ligature rapide de l'ADN est recommandé. L'ADN ligase T4 convient à la plupart des réactions de recombinaison de l'ADN et peut être utilisée pour les ligatures de l'extrémité collante (10 minutes de ligature à température ambiante) ou de l'extrémité émoussée (2 heures ou une nuit de ligature à température ambiante). Cependant, l'E. coli DNA Ligase est plus sélective pour les substrats et est recommandée pour les ligatures sticky-end. Pour la ligature de molécules d'ADN ss ou d'ARN, nous recommandons d'utiliser la T4 RNA Ligase. Références:1. Lehman IR. Science. 1974. 186(4166):790-7.2. Okayama H et Berg P. Mol Cell Biol. 1982. 2(2):161-70.3. Higgins NP et Cozzarelli NR. Methods Enzymol. 1979. 68:50-71.
ZJ26F0535150