L'ADN polymérase I d'E. coli d'Aladin, purifiée à l'aide de la plateforme technologique PerfectProtein™ développée par Aladin, catalyse la polymérisation 5'→3' des désoxyribonucléotides en fonction du gabarit de l'ADN [1]. Elle possède également une activité exonucléasique 5'→3' spécifique des nodules d'ADNd, une activité exonucléasique 3'→5' spécifique de l'ADNss et une activité RNase H [2]. L'activité de synthèse de l'ADN et l'activité exonucléase 5'→3' spécifique de l'encoche de l'ADNsd permettent la synthèse de l'ADN à partir d'un groupe 3'-OH à l'encoche et la dégradation de l'ADN simple brin à l'extrémité 5', ce qui facilite le comblement de l'encoche. Son activité exonucléase 3'→5' spécifique de l'ADN ss remplit une fonction de relecture pendant la synthèse de l'ADN. En présence de dNTP, l'ADN polymérase I d'E. coli présente principalement une activité d'ADN polymérase, tandis qu'en l'absence de dNTP, elle présente une activité d'exonucléase plus spécifique de l'ADN ss, telle qu'une activité d'exonucléase 5'→3' sur l'un ou l'autre brin à l'extrémité 5' d'un ADN ds à extrémité émoussée.La polyvalence de l'ADN polymérase I d'E. coli lui permet d'initier la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN à partir de lacunes ou d'entailles dans l'ADNdb et de dégrader le brin d'ADN complémentaire au brin matrice de l'entaille, ce qui permet la traduction de l'entaille. Il assure également la relecture des mésappariements pendant la réplication de l'ADN et comble les lacunes qui se produisent pendant les processus de réplication et de réparation [3]. Veuillez vous référer à la figure 1 pour connaître les performances de ce produit dans le remplissage des surplombs 5' de l'ADNdb.Figure 1. Performance de l'ADN polymérase I d'Aladdin E. coli dans le remplissage des surplombs 5' de l'ADNdb. Dans une réaction de 20µl (10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 100µM dNTP Mix, 0,5µM d'ADNc avec surplomb de 5', pH 7.9 à 25℃), la quantité spécifiée de ce produit ou de l'ADN polymérase I d'E. coli de la société N (concurrent) a été ajoutée. Après incubation à 37℃ pendant 20 minutes, les réactions ont été terminées par une incubation à 75℃ pendant 20 minutes, suivie d'une analyse PAGE native à 15% de 5µl du produit de la réaction après mélange avec 1µl de tampon de chargement d'ADN 6X . L'électrophorèse a été réalisée à 180V pendant 60 minutes, puis le gel a été coloré avec Gel-Red (10000X) à température ambiante pendant 5 minutes. Les résultats expérimentaux ont été observés sous une lampe UV. Comme le montre la figure, ce produit a une efficacité catalytique similaire à celle du concurrent. Le substrat ADNdb avec un surplomb de 5' a été obtenu par recuit de 5'-ATACATAGATACACTGGCCGTCGTTTTAC-3' et 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' en utilisant le tampon de recuit pour oligos d'ADN (5X) selon les instructions du fabricant. Veuillez vous référer à la figure 2 pour la performance de ce produit dans la digestion de l'ADN linéaire double brin avec des extrémités 3' amino-modifiées.Figure 2. Performance de l'ADN polymérase I d'Aladdin E. coli dans la digestion des extrémités 3' amino-modifiées de l'ADNdb (activité exonucléase 5'→3'). Dans une réaction de 20µl (10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1mM DTT, 0,5µM dsDNA), la quantité spécifiée de ce produit ou de l'E. coli DNA Polymerase I de la société N (concurrent) a été ajoutée. Après incubation à 37℃ pendant 20 minutes, les réactions ont été terminées par une incubation à 75℃ pendant 20 minutes, suivie d'une analyse PAGE native à 15% de 5µl du produit de la réaction après mélange avec 1µl de tampon de chargement d'ADN 6X . L'électrophorèse a été réalisée à 180V pendant 60 minutes, puis le gel a été coloré avec Gel-Red (10000X) à température ambiante pendant 5 minutes. Les résultats expérimentaux ont été observés sous une lampe UV. Comme le montre la figure, ce produit a une efficacité catalytique similaire à celle du concurrent. Le substrat ADNdb avec des extrémités 3' aminomodifiées a été obtenu par recuit de 5'-ATACATAGATACACTGGCCGTCGTTTTAC-3'NH2 et 5'-GTAAAACGACGGCCAGTCTATGTATCTATGTAT-3'NH2 en utilisant le tampon de recuit pour oligos d'ADN (5X) selon les instructions du fabricant. Ce chiffre est donné à titre indicatif et peut varier en fonction des conditions expérimentales.s
Application：
Synthèse de l'ADN ; remplissage complémentaire des surplombs 5' de l'ADNdb ; élimination des surplombs 3' de l'ADNdb ; synthèse du deuxième brin de l'ADNc [4] ; en combinaison avec la DNase I pour la pseudo-traduction de l'ADN ; pseudo-traduction pour obtenir des sondes à haute activité spécifique.
Source：
Purifié à partir d'E. coli avec expression recombinante de l'ADN polymérase I d'E. coli.
Tampon de stockage de l'enzyme：
25mM Tris-HCl, 1mM DTT, 0,1mM EDTA, 50% Glycérol (pH 7,4 à 25 ℃).
Inactivation ou inhibition：
Ce produit peut être inactivé par incubation à 75℃ pendant 20 minutes.
Précautions：
En raison de l'activité exonucléasique de l'ADN polymérase I d'E. coli, éviter les températures ambiantes élevées avant d'effectuer la réaction. L'ADN polymérase I d'E. coli ne possède pas d'activité endonucléasique, ni de DNase I non plus. L'ADN polymérase I d'E. coli ne possède pas d'activité endonucléasique, ni de DNase I. Par conséquent, lors de l'exécution de réactions de pseudo-traduction, la DNase I doit être ajoutée.L'agitation vigoureuse de l'ADN polymérase I d'E. coli peut entraîner l'inactivation de l'enzyme. L'ajout d'une quantité excessive d'enzyme peut conduire à une agrégation, affectant ainsi les réactions d'amplification.L'ADN polymérase I d'E. coli peut polymériser des désoxyribonucléotides marqués avec de la biotine, de la digoxigénine, ou de la fluorescence, etc, permettant la synthèse de sondes ADN marquées.L'enzyme doit être conservée sur de la glace pendant l'utilisation, et stockée à -20℃ immédiatement après l'utilisation.Ce produit est destiné à la recherche et au développement uniquement. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.
Instructions pour l'utilisation：
1. Remplissage des surplombs 5' de l'ADNdb. Préparer la réaction suivante sur de la glace.RéactifVolumeConcentration finaleEau sans nucléase(16-x)μl-dsDNA avec 5' overhangsxμl~0,5µM ou 5-200ng/µl10X Tampon de réaction2μl1XdNTP Mix (2mM chaque)1μl100μME.coli DNA Polymerase I (10U/µl)1μl0.5U/µlVolume total20μl-Note 1 : La quantité d'enzyme peut être réduite de façon appropriée pour éviter le clivage de la matrice en raison de son activité exonucléase.Note 2 : Lorsque plusieurs réactions sont nécessaires, préparer un mélange maître comprenant tous les réactifs sauf l'ADNdb, puis distribuer dans différents tubes PCR exempts de nucléase. Note 3 : Si l'ADNdb avec des surplombs de 5' sont des oligonucléotides, la concentration finale peut être d'environ 0,5µM. Toutefois, pour les plasmides à ADN digéré, la concentration finale peut être d'environ 5-200 ng/µl.b. Bien mélanger et faire tourner dans une micro centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond du tube.c. Incuber à 37℃ pendant 20 minutes. Note : Le temps de réaction peut être ajusté en fonction des situations réelles.d. Incuber à 75℃ pendant 20 minutes pour inactiver l'ADN polymérase I d'E. coli.2. Digestion de l'ADN linéaire double brina. Préparer la réaction suivante sur de la glace.RéactifVolumeConcentration finaleEau sans nucléase(17-x)μl-dsDNAxμl~0,5µM ou 5-200ng/µlTampon de réaction 10X 2μl1XE.coli ADN polymérase I (10U/µl)1μl0.5U/µlVolume total20μl-Note : Lorsque plusieurs réactions sont nécessaires, préparer un master mix comprenant tous les réactifs à l'exception de l'ADNdb, puis le distribuer dans différents tubes PCR exempts de nucléase. Enfin, ajouter l'ADNdb à chaque tube de réaction.b. Bien mélanger doucement, puis faire tourner par impulsion dans une microfuge pour recueillir le liquide au fond du tube.c. Incuber à 37℃ pendant 20 minutes. Note : Le temps de réaction peut être ajusté en fonction des situations réelles.d. Incuber à 75℃ pendant 20 minutes pour inactiver l'ADN polymérase I d'E. coli.3. Pour d'autres applications, veuillez vous référer à la littérature appropriée.FAQ:1. L'ADN polymérase I d'E. coli peut-elle remplir les surplombs de 3' ? Non, l'ADN polymérase I d'E. coli ne peut pas remplir les surplombs de 3'. Elle ne peut que générer des extrémités émoussées en supprimant les surplombs 3'. l'ADN polymérase I d'E. coli, le fragment de Klenow et l'ADN polymérase T4 peuvent être utilisés pour remplir les surplombs de 3'.2. L'ADN polymérase I d'E. coli peut-elle remplir les surplombs de 5' de l'ADN ? Oui, l'ADN polymérase I d'E. coli peut remplir les surplombs de 5' de l'ADN ds. Le fragment de Klenow (, D7037) n'a pas d'activité exonucléase 5'→3' et est recommandé pour le remplissage des surplombs 5'.3. L'ADN polymérase I d'E. coli peut-elle être utilisée pour des expériences de nick translation ? Oui, les expériences de nick translation sont l'une des applications importantes de l'ADN polymérase I d'E. coli.4. Y a-t-il des exigences de température pour les expériences de nick translation ? La température d'incubation pour les expériences de nick translation doit être inférieure à 20℃. À des températures plus élevées, l'ADN nouvellement synthétisé peut se séparer et être répliqué.5. L'ADN polymérase I d'E. coli peut-elle être inactivée par la chaleur ? Oui, ce produit peut être inactivé en le chauffant à 75℃ pendant 20 minutes. L'ajout de 10mM EDTA pour chélater le Mg2+ avant d'effectuer l'inactivation thermique peut protéger les extrémités de l'ADN. 6. L'ADN polymérase I d'E. coli peut-elle éliminer les surplombs 5' ? Non, l'activité exonucléase 5'→3' de ce produit ne s'applique qu'aux lacunes dans l'ADNdb.7. La traduction d'entailles dans l'ADN peut-elle être utilisée pour le marquage de sondes ? Oui, ce produit peut éliminer les bases de la matrice au niveau des entailles grâce à son activité d'exonucléase 5'→3' et remplir les entailles avec des nucléotides marqués. Cette méthode convient pour générer des sondes larges et uniformes, mais avec une efficacité probablement plus faible.Références:1. Kunkel TA, Loeb LA, Goodman MF. J Biol Chem. 1984. 259(3):1539-45.2. Green MR, Sambrook J. Cold Spring Harb Protoc. 2020. 2020(5):100743.3. Yu H, Chao J, Patek D, Mujumdar R, Mujumdar S, Waggoner AS. Nucleic Acids Res. 1994. 22(15):3226-32.4. D'Alessio JM, Gerard GF.Nucleic Acids Res. 1988. 16(5):1999-2014.
