Agarose IgG de lapin

Cat. No.: R749771

Vue d’ensemble

L'agarose IgG de lapin d'Aladdin, également connu sous le nom d'agarose IgG de lapin normal, d'agarose IgG IP de lapin ou de gel d'affinité IgG de lapin, est lié de manière covalente à l'IgG de lapin non spécifique non marquée de haute qualité. Ce produit est couramment utilisé comme contrôle négatif pour les gels d'agarose d'anticorps de lapin tels que le gel d'affinité anti-flag dans les essais d'immunoprécipitation (IP), de co-immunoprécipitation (Co-IP), d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et d'autres essais liés à l'immunoprécipitation. Par ml de gel décanté, on trouve environ 5 mg d'IgG, ce qui est idéal pour éliminer la liaison non spécifique. Ce produit ne reconnaît en principe aucun antigène. Principaux paramètres de l'agarose IgG de lapin

Précautions：

Ce produit contient une petite quantité de conservateur, qui n'affecte pas les tests IP de routine et la purification des protéines. Mais pour les expériences spéciales qui pourraient être perturbées par le conservateur, le gel doit être lavé 3 fois avec des solutions appropriées telles que TBS avant utilisation.Pour les essais d'immunoprécipitation, il est recommandé d'inclure à la fois des contrôles positifs et négatifs. Les échantillons de protéines doivent être purifiés dès que possible après leur collecte et doivent toujours être placés à 4℃ ou sur de la glace pour minimiser la dégradation ou la dénaturation des protéines. La dégradation des protéines peut également être inhibée par l'ajout d'inhibiteurs de protéase appropriés, tels que le Cocktail d'inhibiteurs de protéase à usage général , le Cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase à usage général (MS-safe, 50X) , le Cocktail d'inhibiteurs de protéase pour les extraits de cellules et de tissus de mammifères , le Cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase pour les extraits de cellules et de tissus de mammifères , etc.La capacité de liaison non spécifique de ce produit peut être affectée par des concentrations élevées de DTT, de mercaptoéthanol et de chlorhydrate de guanidine, mais il est applicable au tampon de lyse cellulaire pour Western et IP , au tampon de lyse RIPA et au tampon de lyse NP-40 . Pour les principales caractéristiques et différences des divers tampons de lyse produits par et la sélection des tampons de lyse, veuillez vous référer au site Web à http://www.aladdin-e.com/support/lysis-buffer.htm.If la substance insoluble dans les échantillons de protéines ne peut pas être éliminée complètement par centrifugation, les échantillons peuvent être filtrés avec un filtre de 0,45μm avant d'effectuer l'essai.Ce produit est destiné à la R&D uniquement. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.

Mode d'emploi：

1.Préparation des échantillons de protéinesa.Lyser les cellules ou les tissus avec un tampon de lyse approprié, tel que le tampon de lyse cellulaire 's pour Western et IP . Dans certaines circonstances, le tampon de lyse RIPA fort, le tampon de lyse RIPA moyen ou le tampon de lyse RIPA faible de 's peuvent être utilisés. D'autres tampons de lyse avec un pH6-8 peuvent également être utilisés.a.Après la lyse et la centrifugation, conserver le surnageant à 4℃ ou sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Nous recommandons d'effectuer les procédures suivantes le même jour. Sinon, faire des aliquotes et les conserver à -80℃ pour une utilisation ultérieure.2préparation de l'agarose IgG de lapinL'agarose IgG de lapin étant conservé dans une solution protectrice contenant 50 % de glycérol et une petite quantité de conservateur, il doit être lavé correctement avant d'ajouter les échantillons de protéines.a.Remettre doucement en suspension l'agarose IgG de lapin, transférer 10-20μl de suspension de gel par 500μl d'échantillon dans un nouveau tube à centrifuger.Remarque : Il est plus facile d'aspirer la suspension de gel à l'aide d'un embout de pipette à large orifice (par ex, en coupant une partie de l'embout avec des ciseaux).b.Ajouter 1X TBS (, ST661/ST665) à un volume final d'environ 0,5ml, et remettre doucement en suspension l'agarose IgG de lapin par pipetage ou vortex. Centrifuger à 6000×g pendant 30 secondes à 4℃, retirer soigneusement et jeter le surnageant. Répéter cette étape deux fois.c.Remettre en suspension l'agarose IgG de lapin avec 1X TBS égal au volume initial de la suspension du gel (par ex, si 10μl de suspension de gel sont prélevés, ajouter 10μl de TBS 1X).3.Liaison des protéinesd.Ajouter 20μl d'agarose IgG de lapin lavé pour 100μl d'échantillon de protéine, bien mélanger et incuber à 4℃ pendant 1 à 2 heures ou toute une nuit à 4℃ en agitant doucement sur un mélangeur rotatif.e.Après incubation, centrifuger à 6000×g pendant 30 secondes à 4℃, et éliminer soigneusement le surnageant.Remarque : Une partie du surnageant peut être réservée dans un tube microfuge propre pour l'examen des résultats de la liaison.f.Remettre doucement en suspension l'agarose IgG de lapin dans 500μl de TBS 1X et placer dans un bain de glace sur un agitateur pendant 5 minutes. Centrifuger à 6000×g pendant 30 secondes à 4℃ et éliminer soigneusement le surnageant. Répéter le lavage trois fois, puis conserver l'échantillon sur la glace pour l'élution. 4.ÉlutionEn fonction des caractéristiques de la protéine cible ou de l'utilisation ultérieure, l'une des trois méthodes d'élution suivantes peut être utilisée. Les protocoles suivants sont fournis pour l'élution des protéines cibles à partir du gel d'affinité anti-flag (, P2271). Le contrôle négatif de l'agarose IgG de lapin réalisé en parallèle doit être élué de la même manière. 1) Élution avec un peptide compétitif : il s'agit d'une méthode d'élution non dénaturante avec une efficacité d'élution élevée, et les protéines éluées ne contiennent pas les chaînes légères et lourdes de l'anticorps Flag. a. Préparation du tampon d'élution 3X Flag : Dissoudre le peptide 3X Flag (, P9801-25mg) dans un tampon TBS 1X à une concentration finale de 150μg/ml, ou diluer la solution mère 3X Flag à 5mg/ml (, P9801) avec un tampon TBS 1X à une concentration finale de 150μg/ml.b.Pour chaque 20μl de volume de gel initial, ajouter 100μl de tampon d'élution 3X Flag Peptide (150μg/ml). Remettre l'agarose en suspension délicatement et incuber pendant 30 à 60 minutes à température ambiante sur un mélangeur rotatif , ou 1 à 2 heures à 4℃. Pour améliorer l'efficacité de l'élution, augmenter le temps d'incubation ou répéter l'élution. c.Après incubation, centrifuger à 6000×g pendant 30 secondes à 4℃, et transférer le surnageant dans un nouveau tube microfuge. Le surnageant contient la protéine marquée d'un drapeau et son complexe protéique.d.Conserver le surnageant à 4℃ pour une utilisation immédiate, ou à -20℃/ -80℃ pour un stockage à long terme.2)Élution acide. Cette méthode est non dénaturante, relativement rapide et efficace. Les protéines éluées conservent également leur activité biologique d'origine, ce qui facilite l'analyse et la détection ultérieures.a.Préparation du tampon d'élution acide (Glycine-HCl 0,1M, pH3,0) et du tampon de neutralisation (Tris-HCl 0,5M, pH7,4, NaCl 1,5M). b.Pour chaque 20μl de volume de gel initial, ajouter 100μl de tampon d'élution acide. Remettre l'agarose en suspension délicatement et incuber pendant 5 minutes à température ambiante sur un mélangeur rotatif.Remarque : Le temps d'incubation ne doit pas dépasser 15 minutes.c.Après incubation, centrifuger à 6000×g pendant 30 secondes à 4℃, et transférer le surnageant dans un nouveau tube microfuge. Ajouter immédiatement 10μl de tampon de neutralisation et bien mélanger. d.Pour obtenir une efficacité d'élution maximale, répéter les étapes b-c et combiner le surnageant contenant la protéine marquée d'un drapeau et son complexe protéique .e.Conserver le surnageant à 4℃ pour une utilisation immédiate, ou à -20℃/-80℃ pour un stockage à long terme. Note 1 : L'efficacité d'élution de la méthode d'élution acide peut être inférieure à celle des deux autres méthodes d'élution.Note 2 : L'efficacité d'élution de la méthode d'élution acide dépend des caractéristiques de la protéine cible. Pour obtenir une efficacité d'élution plus élevée, le pH du tampon d'élution acide peut être optimisé entre 2,5 et 3,1. Le pH ou la quantité de tampon de neutralisation nécessaire pour neutraliser les éluats doit également être ajusté de manière appropriée.3)Elution avec le tampon de chargement 1X SDS-PAGE. Il s'agit d'une méthode d'élution dénaturante et les échantillons de protéines obtenus conviennent à l'électrophorèse SDS-PAGE et à l'analyse Western blot. a.Préparation du tampon de chargement SDS-PAGE : Il est recommandé d'utiliser le tampon de chargement des échantillons SDS-PAGE (2X). Habituellement, le tampon de chargement des protéines SDS-PAGE contient un agent réducteur tel que le DTT, et l'échantillon de protéine élué contiendra la chaîne légère et la chaîne lourde de l'anticorps Flag.b.Pour chaque 20μl de volume de gel initial, ajouter 20μl de tampon de chargement d'échantillon SDS-PAGE 2X, bien mélanger et chauffer à 95℃ pendant 5 minutes. c.Centrifuger à 6000×g ou 4℃ pendant 30 secondes. Prendre le surnageant pour l'électrophorèse SDS-PAGE ou l'analyse Western blot.Note : L'agarose ne peut pas être réutilisé car le SDS dans le tampon de chargement détruit les anticorps Flag.FAQ : Problème Causes possibles Solution Une grande quantité de protéines marquées se trouve dans le flux. Le temps de fixation n'est pas suffisant. Si vous utilisez la méthode par lots, augmentez le temps de liaison de manière expérimentale ; si vous utilisez la méthode par colonne, utilisez un débit plus faible lors du chargement des échantillons. La colonne est surchargée. Réduire la quantité d'échantillon ajoutée au gel ou augmenter la quantité de gel. L'étiquette n'est pas accessible au gel. Exposer le tag épitope en ajoutant une faible quantité de dénaturant à l'extrait de protéine (une dialyse peut être nécessaire avant l'application sur le gel), ou fusionner le tag à l'autre extrémité de la protéine cible. Le gel n'a pas été régénéré depuis la dernière purification. Effectuer la procédure de régénération du gel avant la fixation. Problème de compatibilité des réactifs. Dialysez l'échantillon avec du TBS avant la procédure de purification. La protéine cible a été dégradée. 1. Préparer des lysats frais. Éviter d'utiliser des lysats congelés. 2. Effectuer la purification à une température plus basse, telle que 4℃. 3. Utiliser des inhibiteurs de protéase appropriés dans le lysat ou augmenter leurs concentrations pour empêcher la dégradation de la protéine de fusion. Il y a très peu ou pas de protéine marquée dans l'éluat. La protéine n'est pas complètement éluée. Changer de méthode d'élution. Aucune protéine cible n'est exprimée. S'assurer que la protéine d'intérêt contient le tag par des analyses Western blot ou dot blot. Niveau d'expression de la protéine très faible. 1. Utiliser un plus grand volume de lysat cellulaire. 2. Optimiser les conditions d'expression pour augmenter le niveau d'expression de la protéine. Les lavages sont trop rigoureux. 1. Réduire le nombre de lavages. 2. Éviter d'ajouter de fortes concentrations de NaCl au mélange. 3. Utiliser des solutions contenant moins ou pas de détergent. Les temps d'incubation sont insuffisants. Augmenter les temps d'incubation avec le gel d'affinité (de quelques heures à une nuit). Une substance interférente est présente dans l'échantillon. 1. Les lysats contenant de fortes concentrations de DTT, de 2-mercaptoéthanol ou d'autres agents réducteurs peuvent détruire la fonction de l'anticorps et doivent être évités. 2. Des concentrations excessives de détergent peuvent interférer avec l'interaction anticorps-antigène. Les niveaux de détergent dans les tampons peuvent être réduits par dilution. Le système de détection est inadéquat. Si la détection par Western blot est utilisée : 1. Vérifier les anticorps primaires et secondaires en utilisant les contrôles appropriés pour confirmer la liaison et la réactivité. 2. Vérifier que le transfert est adéquat en colorant la membrane avec du Ponceau S. 3. Utiliser un nouveau substrat de détection ou essayer un autre système de détection. Plusieurs bandes de protéines sont présentes dans l'éluat. La protéine n'est pas stable à température ambiante. Purifier la protéine cible à une température plus basse, telle que 4℃. Dégradation de la protéine due à l'activité des protéases pendant le processus de purification. Ajouter des inhibiteurs de protéase au lysat cellulaire. Liaison non spécifique. 1. Préparer à nouveau le lysat cellulaire. 2. Ajouter des étapes de lavage supplémentaires. L'arrière-plan est trop élevé. Les protéines se lient de manière non spécifique à l'anticorps monoclonal, aux billes de gel ou aux tubes de microcentrifugation. 1. Pré-nettoyer le lysat avec de l'agarose IgG de souris ou de l'agarose IgG de lapin pour éliminer les protéines qui se lient de façon non spécifique. 2. Après avoir suspendu les billes pour le lavage final, transférer la totalité de l'échantillon dans un tube de microcentrifugation propre avant la centrifugation. Les lavages sont insuffisants. 1. Augmenter le nombre de lavages. 2. Prolonger la durée des lavages, en incubant chaque lavage pendant au moins 15 minutes. 3. Augmenter les concentrations de sel et/ou de détergent dans les solutions de lavage. 4. Centrifuger à vitesse réduite pour éviter le piégeage non spécifique des protéines dénaturées du lysat lors de la centrifugation initiale des complexes de gel d'affinité. Produits apparentés：Cat. P2265-1ml Agarose IgG de souris 1ml P2265-5ml Agarose IgG de souris 5ml P2267-1ml Agarose IgG de lapin 1ml P2267-5ml Agarose IgG de lapin 5ml P2271-0.5ml Gel d'affinité anti-flag 0.5ml P2271-2ml Gel d'affinité anti-Flag 2ml P2271-10ml Gel d'affinité anti-Flag 10ml P2282-0.5ml Gel d'affinité anti-Flag 0.5ml P2282-2ml Gel d'affinité anti-Flag 2ml P2282-10ml Gel d'affinité anti-Flag 10ml P2285-0.5ml Gel d'affinité anti-Myc 0.5ml P2285-2ml Gel d'affinité anti-Myc 2ml P2285-10ml Gel d'affinité anti-Myc 10ml P2287-0.5ml Gel d'affinité anti-HA 0.5ml P2287-2ml Gel d'affinité anti-HA 2ml P2287-10ml Gel d'affinité anti-HA 10ml P2289-0.5ml Gel d'affinité anti-V5 0.5ml P2289-2ml Gel d'affinité anti-V5 2ml P2289-10ml Gel d'affinité anti-V5 10ml

Spécifications

Product Name

Agarose IgG de lapin

Type de molécule

Bioreagents/Buffer

Product Line

Produits biologiques

Stockage et expédition

Conditions de stockage de stockage

Conserver à -20°C

Expédié en

Glacière + blocs de glace

Stabilité et stockage

Conserver à -20℃ jusqu'à 1 an.