フェムトECL

Cat. No.: W266209

Storage

2-8℃で保存する。

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濡れた氷

概要

包装：100ml(50ml+50ml)、500ml(250ml+250ml)

製品紹介

Femto ECL超高感度基質は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）用の増強型化学発光基質で、次のような特徴があります：

- 高感度-適切な一次抗体と二次抗体を使用することで、ニトロセルロース膜やPVDF膜上のフェムトグラムレベルのタンパク質バンドを検出できます。

- 定量性-得られたシグナルの定量可能な検出範囲は2桁に及ぶ。

- 明るいシグナル-フィルムまたはイメージングシステムによる露光で、画像の取り込みが容易。

- 長いシグナル持続時間-最適化された条件下では、検出可能な光シグナル出力は最大8時間に達する。

- 安定した試薬-キットの構成成分は4℃で1年間安定保存でき、室温では6ヶ月間安定保存できる。

- 経済的な価格-配合は非常に低濃度の抗体検出に適するように最適化されています。

- 1ng～0.2μg/mL一次抗体（1μg/mL原液を1:5,000～1:100,000倍希釈）

- 2ng～10ng/mL二次抗体（1µg/mL原液を1:100,000～1:500,000倍に希釈）

最適な抗体濃度とブロッキングバッファーでFemto ECL基質を使用することにより、従来のECL基質では検出できなかった低濃度の標的タンパク質を検出することができます。

重要なヒント

1 最良の結果を得るためには、サンプルサイズ、一次抗体および二次抗体の濃度、メンブレンやブロッキング試薬の種類など、システムを構成するすべての要素を最適化する必要があります。

2 本製品の使用には、沈殿比色HRP基質検出の使用よりも低い抗体濃度が必要です。抗体濃度を最適化するには、系統的なドットブロット解析を実施してください。

3 全てのシステムに最適なブロッキング試薬はありませんので、各ウェスタンブロット検出システムに最適なブロッキングバッファーを見つけることが非常に必要です。ブロッキング試薬は抗体と交差反応し、非特異的なシグナルを引き起こす可能性があります。ブロッキングバッファーはシステムの感度にも影響します。ある基質から別の基質に切り替えた場合、シグナルの減衰やバックグラウンドの増加が起こることがあります。ブロッキングバッファーが新しい検出系に適していないことが原因かもしれません。

4 アビジン／ビオチン検出系を使用する場合、牛乳をブロッキング試薬として使用することは避けてください。牛乳には定量されていない内因性ビオチンが含まれており、高いバックグラウンドシグナルを引き起こすからです。

5 洗浄液、ブロッキング液、抗体溶液、基質作業液の量は、実験全体を通してブロッティングメンブレンが完全に液体で覆われるようにし、メンブレンの乾燥を防ぐようにしてください。ブロッキングバッファーと洗浄バッファーの使用量を増やすと、非特異的シグナルを減らすことができます。

6 最良の結果を得るためには、インキュベーションの段階でシェーカーを使用してください。

7 ブロッキングバッファーと希釈抗体溶液にTween20（最終濃度0.05～0.1%）を添加し、非特異的シグナルを減少させる。洗剤などは高品質のものを使用してください。アンプルに保存され、過酸化物やその他の不純物の含有量は非常に少ない。

8 緩衝液の防腐剤としてアジ化ナトリウムを使用しないでください。アジ化ナトリウムはHRPの阻害剤である。

9 手とメンブレンが直接触れないようにしてください。実験中は手袋を着用するか、清潔なピンセットを使用してください。

10 すべての器具は清潔で、異物が混入していないこと。金属製の器具（はさみなど）には、目に見える錆があってはなりません。錆はスポット形成や高バックグラウンドの原因となります。

11 基質溶液は室温で8時間安定であること。日光やその他の強い光は、基板を損傷する可能性があります。最良の結果を得るには、基板作業溶液を琥珀色のボトルに保管し、長期的に強い光にさらさないようにしてください。

操作の概要

注意：抗原と抗体の濃度を最適化してください。陽性結果を確実に得るためには、推奨抗体希釈率を使用する必要があります。推奨希釈範囲については、その他の必要資料をご参照ください。

1) 一次抗体濃度を1ng～0.2ng/mLに希釈する（1μg/mL原液を1:5,000～1:100,000倍に希釈）。

2) 二次抗体濃度を2ng～10ng/mLに希釈する（1µg/mL原液を1:100,000～1:500,000倍に希釈する）。

3) 基質2成分を1:1の割合で混合し、基質作業溶液を調製する。

注意：日光やその他の強い光にさらすと、作業液が損傷することがあります。最良の結果を得るために、この作業液は琥珀色のボトルに保管し、強い光に長時間さらさないようにしてください。実験室内の日常的な照明に短時間さらす程度であれば、作業液に損傷を与えることはありません。

4) ブロッティング膜をFemto ECL作業液中で5分間インキュベートする。

5) 余分な試薬を吸引する。清潔なプラスチックフィルムでブロッティング膜を覆う。

6) ブロッティング膜をX線フィルムで露光する。

その他必要な材料

1 転写したブロッティング膜：適切な電気泳動法でタンパク質を分離し、これらのタンパク質をニトロセルロース膜に移す。

2 希釈バッファー：トリスまたはリン酸バッファーを使用する。

3 洗浄バッファー：1000mLの希釈バッファーに5mLの10% Tween-20を加える（Tween-20の最終濃度は0.05%になる）。

4 ブロッキング試薬：100mL のブロッキングバッファーに 10% Tween-20 を 0.5mL 添加し、希釈バッファーと同じ基本成分のブロッキングバッファーを選択する。

5 一次抗体標的タンパク質に特異的な抗体を選択する。希釈バッファーで抗体のストック溶液を調製する。ブロッキング試薬を用いて、抗体をストック溶液から抗体作動溶液に希釈する。最適な希釈倍率は、一次抗体とメンブレン上の抗原量によって異なります。

6 HRP標識二次抗体二次抗体に特異的に結合する HRP 標識二次抗体を選択し、希釈バッファーで抗体保存液を調製する。ブロッキング試薬を用いて、抗体を保存液から抗体作動液に希釈する。希釈は1:100,000～1:500,000、または抗体作業溶液の濃度は2～10ng/mlです。この濃度範囲は、ストレプトアビジン-HRPを使用する場合にも適用されます。二次抗体の最適希釈率は、HRP 標識二次抗体とメンブレン上の抗原量に依存します。

7 X線写真フィルム処理用フィルムカセット、現像・定着試薬

8 インキュベーション用ロータリーシェーカー

ウェスタンブロッティングの詳細手順

1) タンパク質転写装置からインプリントメンブレンを取り出し、適切なブロッキング溶液を加え、温室内で振とうしながら20～60分間インキュベートする。メンブレン上の非特異的タンパク質結合部位をブロックする。注意：前項で推奨した抗体希釈率を使用することが非常に重要です。

2) ブロッキング溶液からメンブレンを取り出し、温室内で一次抗体のワーキング溶液と振とうしながら1時間インキュベートする。

3) バッファーがメンブレンを完全に覆うように、十分な洗浄バッファーをメンブレンに加える。分以上振とうしながらインキュベートし、洗浄バッファー を交換し、このステップを4～6回繰り返す。洗浄バッファー量、洗浄回数、洗浄時間を増やすことで、バックグラウンドシグナルを減少させることができる。

注意：インキュベーションの前に、メンブレンを洗浄バッファーで短時間すすぐと、洗浄効率が向上する。

注意：上記で提案したHRP標識二次抗体の希釈倍率を使用することが非常に重要です。

4) HRP標識二次抗体作業溶液とメンブレンを温室内で振とうしながら1時間インキュベートする。

5)ステップ3を繰り返し、結合していないHRP標識二次抗体を除去する。注：HRP標識二次抗体とインキュベートした後、メンブレンを十分に洗浄する必要があります。

6) A液とB液を等モル比で混合し、ワーキング溶液を調製する。メンブレン1cm2あたり0.01～0.1mlの作業液を使用する。作業液は温室内で8時間安定です。注意：大雨、日光、その他の強い光は、作業液を損傷する可能性があります。最良の結果を得るためには、本作業液は琥珀色のボトルに保存し、長時間の激しい雨や強い光を避けてください。実験室内の一般的な照明では、作業液に害はありません。

7) 作用液中でインプリント膜を5分間インキュベートする。

8) 作用液からインプリント膜を取り出し、プラスチックシートまたは清潔なプラスチック紙（フィルム）に入れます。吸収紙で余分な液を吸収し、インプリントとプラスチック紙の間の気泡を注意深く押し出す。

9)プラスチック紙（フィルム）に包まれたインプリントフィルムを、タンパク質の面を上にしてフィルムカセットに入れます。フィルム露光に適した照明（赤色安全灯など）を除き、すべての照明を消灯する。

注意：露光中はフィルムを濡らさないようにしてください。最良の結果を得るために、以下の対策をとる：

* メンブレンとプラスチックペーパーから余分な基材を完全に取り除く。

* フィルム処理中は手袋を使用してください。

* フィルム上の化学物質が信号を弱めるので、現像済みフィルムの上にインプリントフィルムを置かないでください。

10) X線フィルムをフィルムの上に置きます。最初の露光は60秒を推奨します。露光時間は後で調整して最良の結果を得ることができる。化学発光反応は、基質インキュベーション後の最初の5～30分間が最も強い。この反応は数時間続くが、強度は時間とともに減少する。インキュベーション後、基質を長時間露光する場合は、より強いシグナルを得るために露光時間を延長する必要があるかもしれません。燐光蓄積イメージング装置（バイオ・ラッドのモレキュラー・イメージャー・システムなど）やCCDカメラを使用する場合は、より長い露光時間が必要になることがあります。

警告フィルムとフィルムの間に動きがあると、フィルム上に人為的な非特異的シグナルが生じることがあります。

11) フィルムの現像には適切な現像液と定着剤を使用する。シグナルが強すぎる場合は、露光時間を短くするか、インプリントフィルムを剥がし、抗体濃度を下げて再試験を行う。

よくある問題と解決法

問題点	考えられる問題	解決方法
フィルム上に逆像がある（すなわち、背景が黒く、バンドが白）。	HRPの量が多すぎる。	HRP標識二次抗体を少なくとも10倍に希釈する。
メンブレン上に茶色または黄色のバンド
暗室でインプリントが光る
シグナル持続時間が8時間未満
シグナルが弱い、またはない	システム内のHRPが多すぎると基質が枯渇し、シグナルが急速に減衰する	HRP標識二次抗体を少なくとも10倍に希釈する。
	抗原または抗体の量が不十分	抗体または抗原の量を増やす
	タンパク質の移行率が低い	トランスファーを最適化する
	HRPまたは基質活性が低い	下記を参照
バックグラウンドが高い	システム内のHRP量が多すぎる	HRP標識二次抗体を少なくとも10倍に希釈する。
	閉鎖が不十分	シール条件を最適化する
	密閉式装置が適していない	別のブロッキング試薬を試す
	洗浄が不十分	洗浄時間、洗浄回数、洗浄バッファー量を増やす
	フィルムの露出オーバー	露光時間を短くするか、バックグラウンド除去剤を使用する。
	抗原または抗体の濃度が高すぎる	抗体または抗原の量を減らす。
プロテインバーの斑点	タンパク質の転写効率が低い	転写プロセスを最適化する
	メンブレンの不均一な水和	製造元の推奨に従ってメンブレンを適切に水和させる。
	膜と膜の間に気泡がある	フィルム露光前に気泡を取り除く
フィルムの背景に斑点がある	HRP標識二次抗体に凝集物がある	0.2μmのフィルターを使用する
非特異的バンド	HRPの量が多すぎる	HRP標識二次抗体を10倍以上希釈する。
	SDSによる非特異的タンパク質結合	試験中にSDSを使用しない

*システムの活性を検出するため、1～2mlの基質溶液を清潔な試験管に入れ、暗室で調製した。ランプを消し、希釈していないHRP標識二次抗体作業溶液を1μl加える。溶液は直ちに青色光を発し、青色光のシグナルはその後数分かけて弱まるはずである。

Specifications

保管条件

2-8℃で保存する。

入荷

濡れた氷

化学的性質と物理的性質

• 感度: light sensitive