Mistura UltraSYBR

Cat. No.: U665891

Storage

Conservar a -20°C. Evitar a congelação e descongelação repetidas

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Arca de gelo + almofadas de gelo

Visão geral

O UltraSYBR Mixture é um sistema pré-misturado especificamente concebido para PCR quantitativo de fluorescência em tempo real utilizando o método do corante (SYBR Green I), com uma concentração de 2 x, contendo GoldStar Taq DNA Polymerase, PCR Buffer, dNTPs, corante fluorescente SYBR Green I e Mg2+. A operação é simples e cómoda. Utilizado principalmente para detetar sequências-alvo de ADN genómico e sequências-alvo de ADNc após a transcrição reversa do ARN.
O corante fluorescente SYBR Green I contido neste produto pode ligar-se a todo o ADN de cadeia dupla, tornando-o adequado para a deteção de diferentes sequências-alvo sem a necessidade de sintetizar sondas marcadas específicas. Entre eles, a GoldStar Taq DNA Polymerase é uma enzima de arranque a quente quimicamente modificada, nova e altamente eficiente que não tem atividade de polimerase à temperatura ambiente, evitando eficazmente a amplificação não específica causada pela ligação não específica de primers e modelos ou dimerização de primers à temperatura ambiente. A ativação da enzima requer incubação a 95 ℃ durante 10 minutos. A combinação única de sistema tampão PCR e enzima de arranque a quente inibe eficazmente a amplificação PCR não específica e melhora significativamente a eficiência de amplificação da PCR. Este produto é adequado para instrumentos de PCR quantitativos de fluorescência que não requerem ROX como corante de correção, tais como Roche LightCyster 480, Roche LightCyler 96, Bio rad iCyler iQ, iQ5, CFX96.

U665891	Componente	5 ml	40 ml	Armazenamento
U665891A	mistura 2×Ultra SYBR	5×1 mL	40×1 mL	-20°C. Evitar o ciclo de congelação/descongelação.
U665891B	ddH₂O	5×1 mL	40×1 mL	-20°C. Evitar o ciclo de congelação/descongelação

Caraterísticas do produto
1. Este produto utiliza uma nova e eficiente enzima de arranque a quente GoldStar Taq DNA Polymerase e um sistema tampão PCR único, melhorando significativamente a eficiência de amplificação da PCR com elevada sensibilidade e forte especificidade.
2. Adequado para a deteção de PCR quantitativa por fluorescência, pode quantificar e detetar com precisão os genes alvo.
Questões que requerem atenção
1. Antes de utilizar, misturar suavemente de cabeça para baixo para evitar a formação de espuma e utilizar após uma breve centrifugação.
2. Este produto contém o corante fluorescente SYBR Green I. Ao armazenar este produto ou preparar a solução de reação PCR, evitar a exposição à luz intensa.
3. Evitar a congelação e descongelação repetidas deste produto, uma vez que a congelação e descongelação repetidas podem provocar uma diminuição do desempenho do produto.
4. Este produto não pode ser utilizado para PCR quantitativa de fluorescência com base em sonda.
Ao preparar a solução de reação, utilizar cabeças de pistola e tubos de centrifugação novos ou não poluentes para evitar, tanto quanto possível, a contaminação.

Utilização
Seguem-se exemplos de sistemas de reação PCR convencionais e de condições de reação. Na prática, devem ser feitas melhorias e optimizações correspondentes com base em diferentes modelos, estruturas de primers e tamanhos de fragmentos alvo.
1. Sistema de reação PCR

Reagente	50 μL Sistema de reação	Concentração final
mistura 2×UltraSYBR	25 μL	1 ×
Primário direto，10 µM	1 μL	0.2 μM ¹⁾
Primário inverso，10 µM	1 μL	0.2 μM ¹⁾
ADN modelo	2 μl ²⁾	/
ddH2O	até 50 μl	/

Atenção:
1) Normalmente, a concentração do iniciador é de 0,2 μ M pode obter bons resultados, com uma concentração final de 0,1-1,0 μ M serve como referência para definir o intervalo.
2) A quantidade de ADN modelo baseia-se geralmente em 10-100 ng de ADN genómico ou 1-10 ng de ADNc como referência. Devido aos diferentes números de cópias dos genes alvo contidos nos modelos de diferentes espécies, pode aplicar-se uma diluição em gradiente ao modelo para determinar a utilização óptima do modelo.
3) O sistema de reação recomendado é de 50 μl. O sistema de reação também pode ser aumentado ou reduzido proporcionalmente, de acordo com as necessidades experimentais reais.
2. Programa de reação de PCR:
Atenção! A reação de pré-desnaturação deste produto deve ser concluída a 95 ℃ durante 10 minutos!
Recomenda-se a utilização do método de PCR em duas etapas mostrado na tabela abaixo para a configuração do programa. Este programa toma como exemplo o instrumento de PCR quantitativo de fluorescência ABI7500. Se não for possível obter bons resultados experimentais devido a primers com valores Tm baixos, pode tentar-se um método de amplificação por PCR em três passos. Os passos de operação do método de três passos são detalhados em "Otimização das condições de reação".

Passo	Temperatura	Tempo	/
Pré-desnaturação	95℃	10 min ¹⁾	/
Desnaturação	95℃	15 s	35-40 ciclos
Recozimento/Extensão ² ⁾	60℃	1 min	35-40 ciclos
Análise da curva de fusão ³ ⁾	/	/	/
/	95℃	15 s	/
/	60℃	1 min	/
/	95℃	15 s	/
/	60℃	15 s	/

Atenção:
1) A enzima hot start utilizada neste produto deve ser activada em condições de pré-desnaturação de 95 ℃ e 10 minutos.
2) A temperatura de recozimento deve ser definida em 60-64 ℃ como uma faixa de referência. Quando ocorrem reacções não específicas, a temperatura de recozimento pode ser aumentada.
3) Este programa é baseado no instrumento de PCR quantitativo de fluorescência ABI 7500 como configuração de referência. Para a análise da curva de fusão, utilize o programa recomendado para o instrumento de PCR quantitativo de fluorescência utilizado.

Otimização das condições de reação
Ao otimizar as condições de reação quantitativa de fluorescência, devem ser considerados factores como a concentração do iniciador, a temperatura de recozimento e o tempo de extensão para melhorar a especificidade da reação e a eficiência da amplificação.
1. Um sistema experimental com elevada especificidade de reação e eficiência de amplificação deve satisfazer as seguintes condições
1) Elevada especificidade da reação: controlo negativo sem amplificação não específica, como o dímero do iniciador; não se gera amplificação para além do fragmento alvo.
2) Elevada eficiência de amplificação: valor Ct baixo; a eficiência de amplificação da PCR é elevada, aproximando-se do valor teórico de 100%.
2. Método de otimização das condições de reação:
1) Concentração do iniciador: Normalmente, a concentração do iniciador é de 0,2 μ M pode obter bons resultados, com uma concentração final de 0,1-1,0 μ M serve como referência para definir o intervalo. Se a especificidade da reação for aumentada, a concentração do iniciador pode ser reduzida; se a eficiência da amplificação for melhorada, a concentração dos iniciadores pode ser aumentada, optimizando assim o sistema de reação.
2) Temperatura de recozimento: Recomenda-se a utilização de PCR em duas etapas com uma temperatura de recozimento de 60 ℃ para a reação. Se a especificidade da reação for melhorada, a temperatura de recozimento pode ser aumentada, sendo 60-64 ℃ o intervalo de referência para a definição. Se não for possível obter bons resultados experimentais devido à utilização de iniciadores com valores Tm inferiores, pode tentar-se um método de amplificação por PCR em três fases. A temperatura de recozimento do método de três etapas deve ser definida dentro da faixa de 56 ℃ -64 ℃ como referência.
3) Tempo de extensão: Recomenda-se a utilização de PCR de dois passos com um tempo de extensão de 1 minuto para a reação. Se a eficiência da amplificação for melhorada, pode-se tentar aumentar o tempo de extensão ou tentar o método de PCR de três etapas

Atenção! A reação de pré-desnaturação deste produto deve ser concluída a 95 ℃ durante 10 minutos!

PCR quantitativo de fluorescência de três passos (este programa toma como exemplo o instrumento de PCR quantitativo de fluorescência ABI7500):

Passo	Temperatura	Tempo	/
Pré-desnaturação	95℃	10 min ¹⁾	/
Desnaturação	95℃	10 s	35-40 ciclos
Recozimento	56-64℃ ²⁾	30 s	35-40 ciclos
Extensão	72℃	32 s ³ ⁾	35-40 ciclos
Análise da curva de fusão ⁴⁾	/	/	/
/	95℃	15 s	/
/	60℃	1 min	/
/	95℃	15 s	/
/	60℃	15 s	/

Atenção:
1) A enzima hot start utilizada neste produto deve ser activada em condições de pré-desnaturação de 95 ℃ e 10 minutos.
2) Quando a eficiência de amplificação ideal não puder ser alcançada, reduza adequadamente a temperatura de recozimento; Quando ocorrerem reações não específicas, aumente a temperatura de recozimento.
3) Se for necessário melhorar a eficiência da amplificação da reação, o tempo de extensão pode ser aumentado de forma adequada.
4) Este programa baseia-se no instrumento de PCR quantitativo de fluorescência ABI 7500 como definição de referência. Para a análise da curva de fusão, utilizar o programa recomendado para o instrumento de PCR quantitativo de fluorescência utilizado.

Especificações

Condições de armazenamento de armazenamento

Conservar a -20°C. Evitar a congelação e descongelação repetidas

Enviado em

Arca de gelo + almofadas de gelo

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Produtos biológicos