Ad-mCherry-p62

Cat. No.: A743657

Descripción general

Ad-mCherry-p62 (adenovirus que expresa la proteína de fusión mCherry-p62) es un adenovirus recombinante desarrollado por aladdin, que puede expresar la proteína de fusión roja fluorescente mCherry-p62 con gran eficacia en células o tejidos diana tras la infección. Ad-mCherry-p62 no se recombina con el ADN genómico de las células o tejidos diana, y la expresión de la proteína de fusión mCherry-P62 es transitoria. Por lo tanto, no puede utilizarse para cribar líneas celulares estables. Después de la infección de las células, la expresión de mCherry-P62 puede durar al menos 7 días normalmente y disminuye significativamente después de 10-14 días, lo que puede variar dependiendo del tipo de células y tejidos.El Ad-mCherry-p62 de Beotime emplea un sistema de vector de adenovirus recombinante maduro deficiente en E1 que sólo puede amplificar en líneas celulares que expresan E1 como HEK293A y HEK293, pero no en células ordinarias, reduciendo así eficazmente los riesgos de este producto.p62, también conocido como sequestosoma I (SQSTM1), está altamente conservado en organismos multicelulares (excluyendo plantas y hongos). Se distribuye predominantemente en el citoplasma, pero también está presente en núcleos, autofagosomas y lisosomas. p62, una proteína inducida por el estrés, desempeña un papel importante como centro de señalización en muchos eventos celulares, como la detección de aminoácidos y el estrés oxidativo, y también sirve como proteína andamio para PKC, ERK1, mTORC1, NF-кB y caspasa-8, entre otros. la p62 tiene una longitud de 440 aminoácidos, con múltiples dominios como un dominio PB1, un dominio zinc finger, dos señales de localización nuclear, un dominio de unión a TRAF6 y un dominio LIR. El dominio PB1 N-terminal es necesario para la oligomerización de p62 para formar agregados de proteínas, especialmente cuando las células están expuestas a ambientes oxidativos, y actúa como un centro de organización de señalización responsable de reclutar sustratos proteicos modificados por ubiquitinación. El dominio LIR contiene un cluster rico en aminoácidos ácidos e hidrofóbicos (DDD y WxxL). El cluster ácido y los otros dos aminoácidos clave del dominio LIR, Trp338/Leu341, interaccionan con la proteína LC3 en múltiples sitios, lo que es responsable de dirigir la degradación de las proteínas ubiquitinadas hacia el proteasoma o el autofagosoma. La interacción entre p62 y LC3 también es necesaria para la degradación autofágica de la propia p62, y la inhibición de la autofagia dará lugar a una gran acumulación de p62, seguida de la formación de agregados positivos para la tinción de p62 y ubiquitina. La autofagia es una vía metabólica intracelular altamente conservada evolutivamente para la degradación parcial de sus propios componentes a través de la fagocitosis lisosomal, que se asocia con una variedad de funciones fisiológicas. En condiciones ambientales desfavorables, como la inanición, las células degradan los componentes intracelulares excedentes o anormales a través de la autofagia para proporcionar energía y materias primas para la supervivencia celular y promover el crecimiento y el desarrollo, la diferenciación celular y la respuesta a los cambios ambientales. Las anomalías en la autofagia están estrechamente relacionadas con diversos procesos patológicos como tumores, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades metabólicas e infecciones patógenas. Dado que la autofagia celular desempeña un papel importante tanto en los procesos fisiológicos como patológicos, se ha convertido en un nuevo tema de investigación en el campo de la biología celular.Tras la infección de células con el Ad-mCherry-p62, mCherry-p62 suele presentar fluorescencia en forma de puntos rojos o motas difusivas en el citoplasma y el núcleo bajo microscopía de fluorescencia. Cuando se inhibe la autofagia, los puntos o motas rojos se hacen más grandes y numerosos. El marcaje fluorescente de p62 es una herramienta excelente para estudiar la inducción e inhibición de la autofagia, así como la eliminación de agregados proteicos. Las células NIH3T3 infectadas con el Ad-mCherry-p62 se tiñeron con Hoechst 33342 después de 48 horas post-infección. El título de este producto es ≥1×108 ufp/ml. Si las células se infectan a 20 MOI, 1 ml de este producto es suficiente para infectar 10 pocillos con 500.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos, o 50 pocillos con 100.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos. El número real de pocillos que pueden infectarse depende también del valor MOI utilizado.

Precauciones：

PrecaucionesPrecauciones para el uso de adenovirus" cuidadosamente. Este producto tiene un nivel de bioseguridad 1 (BSL-1). No se sabe que cause enfermedades de forma consistente en adultos sanos y puede utilizarse de acuerdo con las prácticas microbiológicas estándar.Este producto es sólo para I+D. Para su seguridad y salud, por favor use una bata de laboratorio y guantes desechables mientras manipula el reactivo.

Instrucciones de uso：

1. Determinación de las condiciones de infecciónSe proporciona el siguiente protocolo para la infección Ad-mCherry-p62 de células NIH3T3 en placas de 6 pocillos. Realice los ajustes adecuados para la infección de células cultivadas en otros tipos de recipientes. Se requieren diferentes valores de MOI para diferentes tipos de células. Si es la primera vez que se utiliza este producto, optimice las condiciones de infección. a. Cultive células NIH3T3 en placas de cultivo celular de 6 pocillos: El día anterior a la infección, siembre células NIH3T3 a 5×105 células/pocillo en 2 ml de medio de cultivo completo. La densidad celular debe ser aproximadamente del 50% para la infección por el virus. Nota: El número exacto de células inoculadas depende del tamaño celular y de la velocidad de crecimiento celular para conseguir una densidad celular del 50% aproximadamente para la infección por el virus al día siguiente.b. Calcular la cantidad de virus necesaria para obtener un valor MOI de 2, 5, 10, 20 y 40, respectivamente. Consulte el Apéndice 2 para el cálculo.c. Descongele el virus en hielo y mézclelo bien antes de usarlo.d. Saque la placa de 6 pocillos de la incubadora de cultivo celular y examine las células mediante microscopía para asegurarse de que las células están en buen crecimiento. Sustituya el medio de cultivo antiguo por 1,2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo y añada una cantidad adecuada de Ad-mCherry-p62 para obtener un valor MOI específico por pocillo. Mientras tanto, prepare pocillos sin virus como control negativo. Nota: Debe añadirse la menor cantidad posible de medio de cultivo fresco a cada pocillo para aumentar la eficacia de la infección vírica. En placas de varios pocillos con un volumen pequeño de medio de cultivo, como las de 96 y 48 pocillos, el Ad-mCherry-p62 también puede diluirse con medio de cultivo hasta el valor MOI deseado antes de añadirlo.e. Después de 24 horas post-infección, retire el medio de cultivo que contiene virus. Añada 2 ml de medio de cultivo fresco completo por pocillo y continúe incubando durante 24 horas antes de examinar con un microscopio de fluorescencia (Figura 2). El valor óptimo de MOI es el que proporciona una fuerte fluorescencia con una alta eficiencia de infección y no tiene una influencia significativa en el crecimiento celular.Nota 1: Una mayor eficiencia de infección no es necesariamente mejor, porque una eficiencia de infección demasiado alta puede causar fácilmente citotoxicidad e interferir con la detección de la autofagia. Nota 2: La expresión de mCherry-p62 fluorescente puede detectarse normalmente 24 horas después de la infección, y alcanza su máximo a las 48 horas aproximadamente. Nota 3: En casos de alta citotoxicidad después de la infección por adenovirus, puede intentarse la sustitución con medio de cultivo fresco completo 6-12 horas después de la infección. Células NIH3T3 infectadas con Ad-mCherry-p62 (Beytome, #C3016) a diferentes valores de MOI como se indica en la figura. Las células se examinaron 48 horas después de la infección. mCherry-p62 tiene un máximo de excitación a 587 nm y un máximo de emisión a 610 nm.2. Infección celular, inhibición de la autofagia y observación de la fluorescenciaa. Realizar la infección con Ad-mCherry-p62 al valor óptimo de MOI determinado en el paso 1. b. Inducir la autofagia con EBSS (Beytome, #C0213/C0214). Las células sin tratamiento con EBSS se utilizan como control negativo.c. Inhibir la autofagia con inhibidores de la autofagia como la cloroquina o la bafilomicina A1.d. Examinar los cambios de mCherry-p62 fluorescente rojo mediante microscopía de fluorescencia.Apéndice：1. Prácticas de bioseguridad para el uso de adenovirusa. Como virus relativamente seguro, el genoma del adenovirus no se integra en el genoma del huésped ni se replica dentro de la célula después de la infección, pero no se pueden excluir sus riesgos biológicos potenciales. Recomendamos a los usuarios que lean detenidamente esta especificación antes de manipular el virus y que la sigan estrictamente durante la operación. Para obtener más información sobre los niveles de bioseguridad de los CDC de EE.UU. y sus requisitos de manipulación y protección, visite el sitio web: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL5_sect_IV.pdf.b. Utilice cabinas de bioseguridad adecuadas cuando manipule el adenovirus, que pueden variar según los distintos adenovirus. Si se utiliza una campana de flujo laminar, apague el ventilador para evitar la inhalación de polvo contaminado con virus. c. Utilice gorro, mascarilla, guantes y bata de laboratorio desechables para evitar el contacto directo con el adenovirus. No manipule el virus cuando tenga heridas abiertas en el cuerpo. d. Cuando manipule el virus, tenga cuidado de no producir aerosoles ni salpicaduras. Si hay contaminación por virus en la campana de flujo laminar o en otros utensilios, límpielos inmediatamente con etanol al 70% o solución SDS al 2%, o tome otras medidas apropiadas.e. Si se requiere centrifugación, selle bien el tubo de centrifugación antes de centrifugar. Es preferible utilizar una centrifugadora específica para el funcionamiento con virus.f. Para examinar las células después de la infección mediante un microscopio de fluorescencia, deben seguirse los siguientes pasos: apretar el frasco o la placa de cultivo, limpiar la superficie exterior con etanol al 70% y, a continuación, examinar las células mediante microscopía. Después del examen, limpie la platina del microscopio con etanol al 70%.g. Todas las puntas, tubos de centrífuga, recipientes de cultivo, cultivos y guantes contaminados con virus deben esterilizarse durante la noche en desinfectante o solución SDS al 2% antes de desecharlos.h. Lávese las manos con jabón o desinfectante después de quitarse los guantes.2. Cálculo del MOIMOI (Multiplicidad de Infección) viral: Relación entre el número de virus y el número de células a infectar.Pfu (Plaque forming units): El número de partículas de virus biológicamente activas. Las ufp pueden calcularse según la fórmula siguiente: ufp requeridas = número de células x MOIFor ejemplo, para infectar 1×105 células con un virus con un valor de MOI de 2, las ufp requeridas son 2×105. Si el título del caldo vírico es de 1×108 ufp/ml, entonces (2×105 ufp)/(1×108 ufp/ml) = 0,002 ml de caldo vírico. 3. Tabla 1. Resumen de los niveles de bioseguridad recomendados. Resumen de los niveles de bioseguridad recomendados para los agentes infecciososBSLAgentesPrácticasBarreras primarias y equipos de seguridadInstalaciones (barreras secundarias)1No se sabe que causen enfermedades de forma sistemática en adultos sanosPrácticas microbiológicas estándar■ No se requieren barreras primarias.■ EPP: batas y guantes de laboratorio; protección ocular, facial, según sea necesarioSe requiere mesa y fregadero de laboratorio2■ Agentes asociados con enfermedades humanas■ Las vías de transmisión incluyen lesión percutánea, ingestión, exposición de membranas mucosasPráctica BSL-1 más:■ Acceso limitado■ Señales de advertencia de peligro biológico■ Precauciones con objetos punzantes■ Manual de bioseguridad que defina cualquier política necesaria de descontaminación de residuos o vigilancia médicaBarreras primarias:■ BSC u otros dispositivos de contención física utilizados para todas las manipulaciones de agentes que causen salpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos■ EPI: Batas de laboratorio, guantes, protección facial y ocular, según sea necesarioBSL-1 más:■ Autoclave disponible3Agentes autóctonos o exóticos que puedan causar enfermedades graves o potencialmente letales por la vía de exposición por inhalaciónBSL-2 práctica más:■ Acceso controlado■ Descontaminación de todos los residuos■ Descontaminación de la ropa de laboratorio antes de su lavadoBarreras primarias:■ BSC u otros dispositivos de contención física utilizados para todas las manipulaciones abiertas de agentes■ EPI: Ropa protectora de laboratorio, guantes, protección facial, ocular y respiratoria, según sea necesarioBSL-2 más:■ Separación física de los pasillos de acceso■ Acceso con doble puerta de cierre automático■ Aire de escape no recirculado■ Flujo de aire negativo en el laboratorio■ Entrada a través de esclusa o antesala■ Lavamanos cerca de la salida del laboratorio4■ Agentes peligrosos/exóticos que suponen un alto riesgo individual de infecciones de laboratorio transmitidas por aerosol que suelen ser mortales, para las que no existen vacunas ni tratamientos■ Agentes con una relación antigénica estrecha o idéntica a un agente que requiere BSL-4 hasta que se disponga de datos para volver a designar el nivel■ Agentes relacionados con riesgo desconocido de transmisiónBSL-3 prácticas más:■ Cambio de ropa antes de entrar■ Ducha a la salida■ Todo el material descontaminado a la salida de la instalaciónBarreras primarias:■ Todos los procedimientos realizados en BSC de clase III o BSC de clase I o II en combinación con traje de cuerpo entero, con suministro de aire y presión positivaBSL-3 más:■ Edificio separado o zona aislada■ Sistemas dedicados de suministro y escape, vacío y descontaminación■ Otros requisitos descritos en el textoBSL, nivel de bioseguridad; EPI, equipo de protección individual.

Specifications

Product Name

Ad-mCherry-p62

Tipo de molécula

Proteína

Product Line

Productos biológicos

Almacenamiento y envío

Condiciones de almacenamiento de almacenamiento

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Estabilidad y almacenamiento

Conservar a -80℃ hasta 1 año, -20℃ hasta 1-2 meses, o 4℃ hasta 1 semana.