AdPlus-mCherry-GFP-LC3B

Cat. No.: A743666

Descripción general

AdPlus-mCherry-GFP-LC3B de Aladdin es un adenovirus que puede expresar la proteína de fusión mCherry-GFP-LC3B y reconocer CD46 en células o tejidos infectados. El adenovirus común infecta las células a través del receptor CAR, por lo que el nivel de expresión del receptor CAR en la superficie de la célula diana determina la eficacia de la infección por adenovirus. Algunos tipos de células, como las células tumorales primarias, las células madre, las células del músculo esquelético, los linfocitos, los fibroblastos, los macrófagos, las células dendríticas derivadas de monocitos y las células madre hematopoyéticas, tienen una expresión muy baja del receptor CAR en su superficie, lo que se traduce en una baja eficiencia de infección de estas células por adenovirus.A diferencia de los adenovirus comunes, los adenovirus AdPlus tienen una fibra modificada en el sitio de unión al receptor, cambiando su receptor celular de CAR a CD46, que se expresa ampliamente en la mayoría de los tipos celulares, lo que permite que los adenovirus AdPlus infecten una amplia gama de células con una alta eficiencia de transducción.Se cree que los adenovirus AdPlus infectan células humanas con alta eficiencia porque el receptor CD46 está presente en la superficie de casi todas las células humanas con altos niveles de expresión. Aunque las células de rata y ratón teóricamente carecen del receptor CD46, el adenovirus AdPlus es más eficiente que el adenovirus ordinario a la hora de infectar células tumorales murinas, lo que indica que el adenovirus AdPlus puede infectar células no sólo a través del receptor CD46, sino también a través de otras vías desconocidas. Además, AdPlus también es eficiente en la infección de células tumorales, células CD34+, células madre mesenquimales y células madre hematopoyéticas que son infectadas por adenovirus ordinarios con baja eficiencia de infección. LC3 es el homólogo en mamíferos de ATG8, que es una proteína clave en la autofagia de la levadura. La familia de proteínas LC3 incluye las subfamilias LC3A, LC3B, LC3C y GABARAP, entre las que LC3B es la más ampliamente estudiada. LC3B se ha considerado la proteína marcadora más crítica en la vía de señalización de la autofagia. La pro-forma de LC3B que consiste en 125 aminoácidos es escindida por Atg4 en la forma LC3B-I con 22 aminoácidos perdidos en el C-terminal, exponiendo así una glicina C-terminal. En el proceso de autofagia, LC3B-1 sufre un proceso similar a la ubiquitinación y se convierte en la forma LC3B-II con fosfatidiletanolamina (PE) covalentemente unida a la glicina C-terminal, durante el cual ATG7 actúa como la enzima activadora E1-like, ATG3 como la enzima de conjugación E2-like, y el complejo Atg12-Atg5-Atg16 como la ligasa E3-like. A diferencia de LC3B-I, que se localiza en el citoplasma, LC3B-II se localiza en las membranas interna y externa del autofagosoma. Tras la fusión autofagosoma-lisosoma, la LC3B-II de la membrana externa del autofagosoma es escindida por Atg4, mientras que la LC3B-II de la membrana interna es degradada por proteasas en el lisosoma. Aunque LC3B-II tiene un peso molecular mayor que LC3B-I, migra más rápido que LC3B-I durante la electroforesis SDS-PAGE debido a su extrema hidrofobicidad, apareciendo 14kD y 16kD, respectivamente.La autofagia es un proceso intracelular altamente conservado que degrada proteínas de larga vida, orgánulos y otros componentes citoplasmáticos a través de la vía lisosomal. En condiciones desfavorables, como la inanición, las células degradan los componentes intracelulares sobrantes o anormales a través de la autofagia para proporcionar energía y materias primas para la supervivencia celular, promoviendo el crecimiento y el desarrollo de los organismos, la diferenciación celular y las respuestas a los cambios ambientales. La autofagia anormal está estrechamente relacionada con diversos procesos patológicos como tumores, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades metabólicas e infecciones por patógenos. AdPlus-mCherry-GFP-LC3B es un adenovirus recombinante desarrollado por aladdin, que puede expresar eficazmente proteínas LC3B fusionadas con mCherry rojo fluorescente y GFP verde fluorescente en células infectadas.En el proceso de fusión autofagosoma-lisosoma, la fluorescencia de GFP se apagará debido al ambiente ácido dentro del lisosoma, lo que dificulta el seguimiento de la localización intracelular de GFP-LC3B. Sin embargo, mCherry es una proteína fluorescente monomérica del coral de los hongos y su fluorescencia roja es estable en condiciones ácidas. Por tanto, la proteína de fusión mCherry-EGFP-LC3B permite un seguimiento eficaz de los procesos de autofagia. Tras infectar las células con el adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B, las células sin autofagia muestran una fluorescencia amarilla difusa en el citoplasma debido a la combinación de fluorescencia verde y amarilla, mientras que en las células con autofagia, mCherry-GFP-LC3B se agrega en la membrana del autofagosoma y aparece como manchas amarillas (LC3B dot o punctae) o como manchas rojas debido al apagamiento parcial de la fluorescencia GFP durante el proceso de fusión autofagosoma-lisosoma.El adenovirus no integra el gen diana en el ADN genómico de las células infectadas, mediando así únicamente la expresión transitoria de la proteína. El tiempo de expresión efectivo tras la infección de las células in vitro e in vivo no suele ser inferior a 7 días, pudiendo variar en función de los tipos de células y tejidos. Es probable que el nivel de expresión de la proteína de fusión se reduzca considerablemente tras 10-14 días de infección.AdPlus-mCherry-GFP-LC3B de Aladdin es un adenovirus recombinante maduro deficiente en E1 que no puede replicarse ni recombinarse en células ordinarias, lo que reduce eficazmente el riesgo de este producto en organismos vivos.Este producto puede amplificarse en células apropiadas como HEK293A y HEK293 que expresan E1.El título de este producto es superior a 1×108 ufp/ml y puede utilizarse como 108 ufp/ml. MOI (Multiplicidad de Infección) es la relación entre el número de virus y el número de células cuando el virus infecta las células. Cuando se infectan 500.000 células por pocillo de placas de 6 pocillos a 20 MOI, cada ml de este producto puede infectar un total de 10 pocillos; cuando se infectan 100.000 células por pocillo de placas de 24 pocillos a 20 MOI, cada ml de este producto puede infectar 50 pocillos en total. El valor MOI puede ajustarse y el número de pocillos que pueden ser infectados por este producto cambiará en consecuencia.

Precauciones：

La congelación repetida reducirá el título viral. Si es necesario, almacene en alícuotas en el primer uso. Las alícuotas deben realizarse en hielo. Este producto puede almacenarse a 4℃ si se utiliza en el plazo de una semana, pero debe tenerse en cuenta que el título viral disminuye con el tiempo de almacenamiento a 4℃. Si se almacena a -80℃ durante más de un año, el título puede disminuir, y se recomienda volver a valorar este producto antes de usarlo.Por favor, lea el Apéndice 1 "Especificaciones de seguridad para el uso de lentivirus" cuidadosamente antes de usar este producto. El nivel de bioseguridad de este producto es Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1). Este producto es sólo para I+D. No es apto para el uso farmacéutico, doméstico o de otro tipo. Para su seguridad y salud, por favor use una bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

Instrucciones de uso：

1.Determinación de las condiciones de infecciónDefinición de MOI (Multiplicidad de Infección): la relación entre el número de virus y el número de células cuando el virus infecta células. Los valores de MOI requeridos para los distintos tipos de células son diferentes. Para el primer uso de adenovirus, es necesario optimizar las condiciones de infección mediante experimentos. El siguiente protocolo se proporciona para células NIH3T3 cultivadas en placas de 6 pocillos. Un día antes de la infección, inocule 5×105 células en 2 ml de medio de cultivo completo por pocillo de una placa de 6 pocillos. Las células deben ser aproximadamente un 50% confluentes en el momento de la infección por el virus. Nota: El número específico de inoculaciones celulares depende del tipo de célula, del tamaño celular, de la tasa de crecimiento celular y de otros factores.b.Consultando el Apéndice 2, calcule la cantidad de virus necesaria para obtener los valores MOI de 2, 5, 10, 20 y 40, respectivamente.c.Descongele el virus en hielo y mézclelo bien antes de utilizarlo.d.Saque la placa de 6 pocillos de la incubadora y observe las células al microscopio para asegurarse de que las células están en buen estado de crecimiento. Sustituir el medio de cultivo antiguo por 1,2 ml de medio de cultivo fresco y pipetear la cantidad adecuada de virus, calculada en el paso b, en los pocillos correspondientes. Mientras tanto, prepare los pocillos sin virus como control negativo. Debe prestarse especial atención a añadir la menor cantidad posible de medio de cultivo fresco para aumentar la eficiencia de infección del virus. Para placas de múltiples pocillos con un volumen pequeño de medio de cultivo, como las placas de 96 pocillos y las placas de 48 pocillos, el virus puede diluirse con medio de cultivo hasta el valor MOI deseado antes de la adición.e.Aproximadamente 24 hpi (horas post-infección), reemplazar el medio que contiene el virus con 2ml de medio completo fresco a cada pocillo, y continuar cultivando células durante 24h, luego comprobar el estado de crecimiento celular y el nivel de expresión de proteínas fluorescentes bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1-4, la eficiencia de infección del adenovirus AdPlus es obviamente mayor que la del adenovirus ordinario). El valor MOI y el tiempo de post-infección óptimos son aquellos en los que el crecimiento celular es relativamente bueno, con alta expresión de GFP y alta eficiencia de infección del virus. Nota 1: Una eficiencia de infección del 20-70% suele ser suficiente para los ensayos de autofagia. Nota 2: Por lo general, la expresión de la proteína fluorescente puede ser visible después de 24 horas de la infección por adenovirus, con una mayor expresión en torno a 48 hpi.Nota 3: En caso de fuerte citotoxicidad después de la infección por adenovirus, la sustitución del medio que contiene el virus con medio de cultivo completo fresco después de 6-12 hpi se puede intentar.Figura 1. Expresión de mCherry-GFP en el medio de cultivo. Expresión de proteínas de fusión mCherry-GFP-LC3B en células NIH3T3 infectadas con 's Ad-mCherry-GFP-LC3B . A, B, C, D, E y F son imágenes de células NIH3T3 infectadas con Ad-mCherry-GFP-LC3B a valores MOI de 0, 2, 5, 10, 20 y 40 durante 48h, respectivamente. Imágenes tomadas en campo claro (panel superior) e imágenes de la misma vista en el canal GFP (panel central) y en el canal mCherry (panel inferior). Expresión de proteínas de fusión mCherry-GFP-LC3B en células NIH3T3 infectadas con 's AdPlus-mCherry-GFP-LC3B . A, B, C, D, E y F son imágenes de células NIH3T3 infectadas con AdPlus-mCherry-GFP-LC3B a valores MOI de 0, 2, 5, 10, 20 y 40 durante 48h, respectivamente. Imágenes tomadas bajo campo claro (panel superior) e imágenes de la misma vista bajo canal GFP (panel central) y canal mCherry (panel inferior).Figura 3. Expresión de mCherry-GFP-LC3B en células infectadas con AdPlus-mCherry-LC3B. Expresión de proteínas de fusión mCherry-GFP-LC3B en células A549 infectadas con 's Ad-mCherry-GFP-LC3B . A, B, C, D, E y F son imágenes de células NIH3T3 infectadas con Ad-mCherry-GFP-LC3B a valores MOI de 0, 2, 5, 10, 20 y 40 durante 48h, respectivamente. Imágenes tomadas en campo claro (panel superior) e imágenes de la misma vista en el canal GFP (panel central) y en el canal mCherry (panel inferior). Expresión de proteínas de fusión mCherry-GFP-LC3B en células A549 infectadas con 's AdPlus-mCherry-GFP-LC3B . A, B, C, D, E y F son imágenes de células NIH3T3 infectadas con AdPlus-mCherry-GFP-LC3B a valores MOI de 0, 2, 5, 10, 20 y 40 durante 48h, respectivamente. Imágenes tomadas bajo campo claro (panel superior) e imágenes de la misma vista bajo canal GFP (panel central) y canal mCherry (panel inferior).2.Observación de células infectadas, autofagia inducida y fluorescencia Tras realizar experimentos de infección vírica utilizando las condiciones determinadas en el paso 1, inducir la autofagia con EBSS u otros inductores apropiados y, a continuación, observar los cambios de fluorescencia bajo un microscopio de fluorescencia.Apéndice:1.Especificaciones de seguridad para la manipulación de adenovirus:a.Como virus relativamente seguro, aunque el genoma del adenovirus no se integra en el genoma de la célula huésped ni se replica en las células tras la infección, sigue presentando riesgos biológicos potenciales. Recomendamos a los usuarios que lean detenidamente las especificaciones antes de manipular el virus y que operen en estricta conformidad con los requisitos. Para conocer los niveles de bioseguridad más estrictos de los CDC de EE.UU. y sus requisitos de funcionamiento y protección, consulte el Apéndice 1 o visite el siguiente sitio web: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL5_sect_IV.pdf.b.Biosafety para las operaciones con adenovirus deben utilizarse cabinas de los niveles correspondientes, y los niveles de bioseguridad varían para los distintos adenovirus. Cuando se utilice una campana de flujo laminar ordinaria para operar con el virus, por favor, no encienda el extractor de aire para evitar que el polvo que pueda estar contaminado por el virus sea soplado hacia el operador y sea inhalado.c.Durante los experimentos deben utilizarse gorros desechables, máscaras, guantes de laboratorio y batas especiales de laboratorio para evitar el contacto directo con el virus. La manipulación del virus está prohibida cuando hay heridas abiertas en las manos y la cara.d.Tenga cuidado de no producir aerosoles o salpicaduras al manipular el virus. Si la campana de flujo laminar u otros utensilios son contaminados por el virus durante la operación, por favor límpielos con etanol al 70% o solución SDS al 2% inmediatamente, o tome otras medidas apropiadas.e.Si se requiere centrifugación, use un tubo de centrífuga bien sellado, o séllelo con parafilm y centrifugue, preferiblemente usando una centrífuga designada para la operación con virus.f.Los siguientes pasos deben seguirse cuando se observe la infección celular bajo un microscopio: Apretar el matraz de cultivo o cubrir la placa de cultivo, limpiar la superficie exterior del matraz o de la placa de cultivo con etanol al 70% y, a continuación, examinar al microscopio. Una vez finalizado el examen, limpie la mesa del microscopio con etanol al 70%. g. Todas las puntas de pipeta, tubos de centrífuga, placas de cultivo (platos, botellas), solución de cultivo, guantes y otros consumibles contaminados con virus deben sumergirse en desinfectante o SDS al 2% durante toda la noche antes de desecharlos. h. Después de quitarse los guantes, lávese las manos con jabón o desinfectante de manos.2cálculo de la MOI del virus:La MOI (Multiplicidad de Infección) se define como la relación entre el número de virus y el número de células cuando el virus infecta las células.La ufp (unidades formadoras de placas) define el número de partículas de virus biológicamente activas.La ufp necesaria puede calcularse según la siguiente fórmula.ufp necesaria = número de células x MOIFor ejemplo: Si se necesitan 2 MOI de virus para infectar 1 × 105 células, la ufp requerida = (1 × 105 células) × (2 MOI) = 2 × 105 ufp. Para una reserva de virus con un título de 1×108 ufp/ml, el volumen de reserva de virus necesario será de 2×105 ufp / (1×108 ufp/ml) × 1000 = 2μl.Tabla 1. Niveles de bioseguridad y su funcionamiento. Niveles de bioseguridad y sus requisitos de funcionamiento y protección.BSLAgentesPrácticasBarreras primarias y equipos de seguridadInstalaciones(Barreras secundarias)1No se sabe que causen enfermedades de forma sistemática en adultos sanosPrácticas microbiológicas estándar■ No se requieren barreras primarias.■ EPP: batas y guantes de laboratorio; protección ocular, facial, según sea necesarioSe requieren mesa y fregadero de laboratorio2■ Agentes asociados con enfermedades humanas■ Las vías de transmisión incluyen lesiones percutáneas, ingestión, exposición de mucosasPráctica BSL-1 más: ■ Acceso limitado■ Señales de advertencia de peligro biológico■ Precauciones con objetos punzantes■ Manual de bioseguridad que defina cualquier política necesaria de descontaminación de residuos o vigilancia médicaBarreras primarias:■ BSC u otros dispositivos de contención física utilizados para todas las manipulaciones de agentes que causen salpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos■ EPI: Batas de laboratorio, guantes, protección facial y ocular, según sea necesarioBSL-1 más:■ Autoclave disponible3Agentes autóctonos o exóticos que puedan causar enfermedades graves o potencialmente letales por la vía de exposición por inhalaciónBSL-2 práctica más: ■ Acceso controlado■ Descontaminación de todos los residuos■ Descontaminación de la ropa de laboratorio antes del lavadoBarreras primarias:■ BSC u otros dispositivos de contención física utilizados para todas las manipulaciones abiertas de agentes■ EPI: Ropa protectora de laboratorio, guantes, protección facial, ocular y respiratoria, según sea necesarioBSL-2 más:■ Separación física de los pasillos de acceso■ Acceso con doble puerta de cierre automático■ Aire de escape no recirculado■ Flujo de aire negativo en el laboratorio■ Entrada a través de esclusa o antesala■ Lavamanos cerca de la salida del laboratorio4■ Agentes peligrosos/exóticos que suponen un alto riesgo individual de infecciones de laboratorio transmitidas por aerosol que suelen ser mortales, para las que no existen vacunas ni tratamientos■ Agentes con una relación antigénica estrecha o idéntica a un agente que requiere BSL-4 hasta que se disponga de datos para volver a designar el nivel■ Agentes relacionados con riesgo desconocido de transmisiónBSL-3 prácticas más:■ Cambio de ropa antes de entrar■ Ducha a la salida■ Todo el material descontaminado a la salida de la instalaciónBarreras primarias:■ Todos los procedimientos realizados en BSC de clase III o BSC de clase I o II en combinación con traje de cuerpo entero, con suministro de aire y presión positivaBSL-3 más:■ Edificio separado o zona aislada■ Sistemas dedicados de suministro y escape, vacío y descontaminación■ Otros requisitos descritos en el textoBSL, nivel de bioseguridad; EPI, equipo de protección individual.

Specifications

Product Name

AdPlus-mCherry-GFP-LC3B

Tipo de molécula

Proteína

Product Line

Productos biológicos

Almacenamiento y envío

Condiciones de almacenamiento de almacenamiento

Conservar a -80°C

Enviado en

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Estabilidad y almacenamiento

Almacenado a -80 ℃, válido durante un año.Almacenado a -20 ℃, válido durante 1-2 meses. Almacenado a 4 ℃, válido durante una semana.