O Trizol é um reagente para a extração de ARN total de células ou tecidos. Este produto adopta os mesmos princípios e métodos que o TRlzol da Invitrogen, com métodos e passos de extração idênticos. A cor do Trizol é a mesma que a do TRIzol. Após a adição de clorofórmio, a camada superior apresenta-se incolor e a camada inferior apresenta-se vermelha, facilitando a absorção da fase aquosa superior. O ARN extraído por Trizol está isento de contaminação por ADN e proteínas. O valor A260/280 do ARN obtido por dissolução em água DEPC é geralmente de 1,8-2,0. Quando as células são lisadas ou homogeneizadas com tecidos, o Trizol pode manter a integridade do ARN na amostra, inibindo eficazmente a degradação do ARN. podem obter-se 5-15 μ g de ARN extraindo 1x106 células com Trizol; a extração com Trizol pode produzir 1-10 μ g de ARN por mg de tecido. O rendimento varia consoante as células e os tecidos. O RNA extraído por Trizol pode ser usado diretamente para Northern blotting, hibridização pontual, purificação de mRNA, tradução in vitro, ensaio de proteção de RNase, clonagem de cDNA e RT-PCR; Também pode ser usado para análise de chip de expressão gênica, sequenciamento de alto rendimento e outras situações que requerem alta qualidade de RNA.
Precauções：
1. Se for necessário medir a razão A260 / A280 do RNA, é recomendado diluir a amostra com tampão de quantificação de RNA para medição.
2. Todos os tubos de centrifugação, cabeças de pistola e soluções relacionadas devem estar livres de contaminação por RNAse. Os objectos resistentes a altas temperaturas podem ser cozidos a 180°C durante 4 horas para remover as enzimas de ARN. Para outros objectos, as enzimas de ARN podem ser removidas 1. mergulhando-os durante a noite em água DEPC a 0,01%, seguida de esterilização e secagem. A solução deve ser preparada com água DEPC. Adicionar 0,01% de DEPC a água re-destilada ou água de grau MiliQ, tratar durante a noite e esterilizar para obter água DEPC.
3. A eficácia da extração de ARN total de células ou tecidos congelados é geralmente inferior à de células ou tecidos frescos. Com efeito, durante o processo de congelação e descongelação das células ou dos tecidos, são libertadas algumas RNases no interior das células ou dos tecidos e as amostras são cisalhadas. Se o ARN não puder ser extraído atempadamente, recomenda-se que se adicione primeiro uma quantidade adequada de Trizol, se proceda à lise da amostra e se congele em seguida.
4. Devem ser utilizadas luvas descartáveis durante a operação e tentar não exalar ou falar na direção das amostras de ARN para evitar a contaminação com enzimas de ARN. Recomenda-se a utilização de uma máscara descartável durante a operação.
5. O Trizol contém uma substância tóxica, o fenol, pelo que se deve evitar o contacto com a pele ou a inalação. Para evitar salpicos para os olhos, usar óculos de proteção ou utilizar um ecrã de proteção transparente. Se a pele entrar em contacto com o Trizol, lavar imediatamente com uma grande quantidade de detergente e água. Se o desconforto persistir, consultar um médico.
Instruções de utilização：
1 Pasta de amostra
1.1 Determinar o tipo de amostra e homogeneizá-la à temperatura ambiente de acordo com a tabela abaixo. O volume da amostra não pode exceder 10% de Trizol. É necessário garantir a utilização de quantidades suficientes de Trizol, uma vez que quantidades insuficientes de Trizol podem levar à contaminação do RNA por DNA.
Tipo
| processo
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organização
| 1. 50-100mg de tecido+1mL de Trizol;
2. Utilizar um homogeneizador para homogeneizar a amostra.
Atenção: Depois de recolher as amostras, efetuar imediatamente a experiência ou congelá-las imediatamente.
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Células aderentes
| 1. Retirar o meio de cultura;
2. Adicionar 1mL de Trizol a cada 10cm2 de placa de cultura;
Nota: Adicionar 1mL de Trziol a uma placa de cultura de 35mm, 3mL de Trziol a uma placa de cultura de 60mm e 8mL de Trziol a uma placa de cultura de 100mm, independentemente do número de células;
3. Utilizar uma ponta de pipeta para soprar e lisar repetidamente as células numa placa de cultura.
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Célula em suspensão
| 1. Depois de recolher as células por centrifugação, remover o meio de cultura;
2. Adicionar 0,75mL de Trizol a 0,25mL de amostra (5-10x106 células, animais, vegetais ou de levedura, ou 10x107 células bacterianas);
Nota: Não lavar as células antes de adicionar Trizol para evitar aumentar a possibilidade de degradação do ARNm;
3. Soprar e bater repetidamente para lisar as células; as células de leveduras e de bactérias têm de ser homogeneizadas. |
1.2 (Opcional) Quando preparar o ARN de amostras que contenham uma grande quantidade de gordura, proteínas, polissacáridos ou matriz extracelular (como músculo, gordura ou tecido vegetal), é necessário um passo adicional de centrifugação para remover as substâncias insolúveis da amostra. Atenção: Se for efectuada uma separação de ADN, não centrifugar.
Tipo
| processo
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Tecidos ou células com elevado teor de gordura, proteínas, polissacáridos ou matriz extracelular
| 1. Após homogeneização, centrifugar a 12000 g durante 10 minutos a 4 ° C;
Nota: O precipitado contém matriz extracelular, polissacáridos e ADN de elevado peso molecular, enquanto o sobrenadante contém ARN. Em amostras com elevado teor de gordura, a camada superior do sobrenadante é a camada de gordura;
2. Remover a camada de gordura;
3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de ensaio. |
2 Separação de fases:
2.1 Incubar o homogenato à temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir a separação do complexo proteico nuclear;
2.2 Adicionar 0,1mL de reagente de separação de fases BCP ou clorofórmio a cada 1mL de lama preparada com Trizol e tapar bem;
2.3 Agitar vigorosamente o tubo de ensaio durante 15 segundos;
2.4 Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos;
2.5 Centrifugar 12000g a 4 ° C durante 15 minutos;
Atenção: O lisado divide-se numa camada vermelha de fenol BCP (camada de clorofórmio), uma camada intermédia e uma fase aquosa incolor. O ARN é completamente retido na fase aquosa. A fase aquosa superior representa aproximadamente 50% do volume total;
2.6 Inclinar o tubo de ensaio 45 graus, tendo o cuidado de extrair a solução da camada superior e não perturbar a camada intermédia e a camada de fenol;
2.7 Transferir a solução superior para um novo tubo de ensaio;
3 Precipitação do ARN
Adotar medidas preventivas adequadas para evitar a contaminação por RNase.
3.1 (Opcional) Ao precipitar o ARN de pequenas amostras (<10 ° células ou <10 mg de tecido), devem ser adicionados à fase aquosa 5-10 μ g de glicogénio isento de RNase; Atenção: O glicogênio co precipita com o RNA, e quando sua concentração é ≤ 4mg / mL, não inibe a síntese da primeira fita ou a reação de PCR.
3.2 Adicione 0,5 ml de isopropanol à fase aquosa obtida após a homogeneização de 1 ml de Trizol;
3.3 Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos;
3.4 Centrifugar a 12000g durante 10 minutos a 4 ° C;
Nota: Antes da centrifugação, o ARN não é visível. Após a centrifugação, formam-se precipitados semelhantes a gel no fundo e nas paredes laterais do tubo de ensaio.
4 Lavagem do ARN
4.1 Remova o sobrenadante do tubo de ensaio, deixando apenas o precipitado de ARN;
4.2 Lave o precipitado com 1mL de etanol a 75% (a partir do precipitado obtido com 1mL de Trizol);
4.3 Agitar brevemente em vórtice e, em seguida, centrifugar a 7500 g durante 5 minutos a 4 °C para obter o sobrenadante;
ZJ26F0938897