PreScission Protease

Cat. No.: P749387

Visão geral

PreScission Protease é uma protease 3C de rinovírus humano (HRV) tipo 14 expressa recombinantemente e purificada a partir de Escherichia coli. Em condições de baixa temperatura (4 ℃), pode clivar especificamente substratos de proteína com a sequência de reconhecimento de Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro ou Leu-Phe-Gln-Gly-Pro entre os resíduos Gln e Gly, e é frequentemente usado para remover Glutationa S-transferase, His ou outras tags em proteínas de fusão. Ao adicionar a sequência de reconhecimento da Protease PreScission entre a etiqueta e a proteína alvo, existem apenas dois resíduos de aminoácidos extra (Gly-Pro) no terminal N das proteínas alvo após a remoção das etiquetas, minimizando assim o possível impacto na estrutura e função das proteínas alvo. Após a digestão na coluna, a etiqueta GST clivada e a PreScission Protease marcada com GST permanecem na Resina de Purificação GST-tag, enquanto as proteínas alvo com a etiqueta GST removida podem ser obtidas a partir da porção de fluxo. Para obter o protocolo detalhado de purificação de proteínas marcadas com GST e remoção de marcadores GST, consulte a resina de purificação UltraBio™ GST-tag da Aladdin ou o kit de purificação de proteínas marcadas com GST

Precauções：

100mM ZnCl2, 4mM AEBSF e 100μM Chymostatin inibirão a atividade enzimática da PreScission Protease em mais de 50%. Este produto é apenas para P&D. Para sua segurança e saúde, por favor use uma bata de laboratório e luvas descartáveis durante a operação.

Instruções de utilização：

1. Condições iniciais de reação (adequadas para a digestão da maioria das proteínas marcadas com GST)a. Temperatura de reação: 4 ℃.b. Tempo de reação: 16 horas ou durante a noite.c. Quantidade de enzima: 1:25~1:100 (U/μg).2. Otimização das condições de reaçãoDependendo das caraterísticas das diferentes proteínas, a proporção de PreScission Protease para a proteína na reação pode ser otimizada da seguinte forma:a. Configure a reação em um tubo de microcentrífuga com gelo e misture bem.ComponenteVolume (μl)H2OX10X PreScission Buffer10Tagged Protein (100μg)YPreScission Protease (2U/μl)0, 0.5, 1 ou 2Volume total100Nota: Se a concentração de proteína marcada for 5μg/μl, então Y=20μl.b. Coloque a mistura de reação a 4℃ durante 16 horas ou de um dia para o outro.c. Retire 20μl da mistura de reação para análise de eletroforese SDS-PAGE para determinar a quantidade adequada de enzima necessária para a reação. Se necessário, pode retirar-se uma pequena quantidade da mistura de reação em diferentes períodos de tempo para determinar o tempo de reação ideal.3digestão na coluna de proteínas marcadas com GST (o protocolo seguinte é para 8 mg de proteína/ml de gel; para quantidades diferentes de proteína, a quantidade de reagentes utilizados deve ser ajustada proporcionalmente). Este protocolo é fornecido para clivar 8 mg de proteínas marcadas com GST em 1 ml de GST-tag Purification Resin. a. Depois de a proteína marcada com GST ser ligada à coluna de purificação (1 ml de resina) e totalmente lavada com o tampão de lavagem, equilibrar a coluna com 10 ml de PreScission Buffer. O PreScission Buffer consiste em 50mM Tris-HCl pH7,5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT.b. Preparar PreScission Protease: utilizar 20U PreScission Protease por mg de proteína marcada com GST (ou seguir as condições optimizadas no passo 2). Para 8 mg de proteína marcada com GST, são necessárias 160 U de PreScission Protease, que devem ser diluídas com tampão PreScission até um volume final de 1 ml.c. Deite o 1 ml de PreScission Protease diluído na coluna de purificação e incube a 4ºC durante 4-8 horas ou de um dia para o outro para garantir uma digestão completa. Se a ligação das proteínas for efectuada num tubo de centrifugação, a PreScission Protease preparada pode ser adicionada diretamente ao tubo de centrifugação e incubar com agitação suave a 4ºC durante 4-8 horas ou de um dia para o outro para garantir uma digestão completa.d. Lavar a coluna três vezes com 1 ml de tampão PreScission cada e recolher cada eluato separadamente. Se a reação de digestão for realizada num tubo de centrifugação, centrifugar 1000×g durante 2 minutos para recolher o sobrenadante. O eluato contém proteínas-alvo com a etiqueta GST removida, enquanto a etiqueta GST e as proteínas marcadas com GST não removidas ainda estão ligadas à resina de gel.4este protocolo é fornecido para clivar 8 mg de proteínas marcadas com GST após a purificação e a eluição. a. Remover GSH ou imidazol do eluato utilizando uma coluna de dessalinização ou diálise com o tampão PreScission.b. Adicionar 2U de PreScission Protease por 100 μg de proteína marcada com GST e incubar a 4ºC durante 4-8 horas ou durante a noite. Se a proteína não for quantificada, adicionar 160 U de PreScission Protease por 1 ml de gel, o que tem uma capacidade de ligação de 8 mg de proteína marcada com GST por ml de gel. c. Adicionar a amostra de proteína digerida à GST-tag Purification Resin que foi pré-equilibrada com tampão PreScission e incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente. d. Centrifugar a 500 × g durante 5 minutos, recolher o sobrenadante que contém a proteína alvo com a marca GST removida. As proteínas não cortadas com a etiqueta GST e as Proteases PreScission são mantidas na resina.

Specifications

Product Name

PreScission Protease

Tipo de molécula

Enzyme

Armazenamento e envio

Condições de armazenamento de armazenamento

Armazenar a -20°C

Enviado em

Arca de gelo + almofadas de gelo

Estabilidade e armazenamento

Armazenar a -20°C.

Perguntas frequentes

How should this product be stored?

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