B Assays of cellular function
B Assays of cellular function
Author: J.E. Collier et al, Translated by Xuedao Cao et al. This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".
Operation method
B Assays of cellular function Move Basic Scenario 1 Antigen-specific antibody production Material Cells were resuspended in 200ul complete medium (both plates). Place the cells on ice before the assay. 2 X R P M I 1640 medium with bicarbonate (Invitrogen) SeaPlaque low melting point agarose (F M C BioProducts) 5.- Dispense 50 ul of TNP-SRBC into 6 to 8 tubes. Examine 1 or 2 slides, pour the mixture onto the slide and spread it out along the edge of the tube (the slide is orange-red). 6 . Transfer IOOul of cells from the first well of the washed plate (if using polyclonal stimulant use a smaller volume, e.g., 20-50ul; if the inducer is weak use a larger volume, e.g., 120ul), blowing on the bottom of the wells several times so that all the cells are transferred to the first tube containing agarose. 7 . Remove the glass tube from the water bath, holding it firmly to prevent spilling of the contents, and mix with a mixer with a rubber pad with 2 pieces of gauze. Invert the glass tube to pour the mixture onto the first slide. Spread the agarose quickly through the mouth of the glass tube onto the glass surface. 8 . Repeat steps 6 and 7 to finish processing the 10 tubes; do not move the slides until they are dry and do not leave them surface up for too long or they will dry out. After the first 5 to 10 slides are done, place them face down on a homemade slide box. 9 . Repeat steps 5 to 8 for the remaining glass tubes and slides until all the culture has been transferred from the tubes to the slides. 10. Overlap the slide cassettes (or slide holders and staining cylinders), place another slide cassette on top, and cover with a damp cloth and a large plastic bag (the latter is optional). 11. Incubate for lh at 37°C in a CO2-free environment. 12. Dilute guinea pig reagent with DPBS (usually 48 ml of 1:20 or 1:25 diluted reagent per slide cassette), warm and homogenize (do not shake vigorously), maintain at 37°C. 13. Remove the wet cloth from the outside of the slide cassette. Flood the slide with diluted complement from one end of the slide with an IOml or 20mL pipette, keeping the tip of the pipette close to the edge of the slide to ensure that there are no air bubbles under the slide. 14. Incubate for lh at 37°C in the absence of CO2 . 15. Gently place the slides on slide holders and immerse the slide holders in a staining vat containing 0.85% (m/V) NaCl. 16. Observe the slide immediately or after storing at 4°C for several hours. The number of empty spots is counted by illuminating the agarose layer with indirect light under a low-power binocular autopsy microscope (enlarged 10 times). Empty spots appear as color circles in the SRBC layer of agarose. If particles are seen in the vacuoles, they are considered to be false vacuoles. Proper absorption of guinea pig complement is important for this assay. Also, complement should be used immediately after lysis and not refrozen. All reagents should be used at room temperature to avoid the formation of air bubbles in the chambers. Slide chambers should be sealed with wax within 20 minutes of filling to avoid drying out. Wax (tissue preparation grade) R P M I or IF1 2 complete medium with additives 7.5% (V7 V ) S R B C or 15 % T N P - S R B C (see Supporting Program 3) B cells washed from cultured cells (see Basic Plan 1) 50 % (V/V) guinea pig complement in complete medium (e.g. Life Technologies, ColoradoSerum) 120 cm2 glass petri dish 9 6-well U-bottom microtitration plate The following is an example of a 6-well U-bottom microtitre plate (Fig. 2.5.2A). The number of transferred cells should be adjusted to not more than 75 ~ IOOPFC/chamber. 4. Submerge them in hot wax so that both sides of the chamber are closed (step 1). Place the slides on a slide rack or on a tray in a CO2 incubator. and incubate at 37°C for 1h. 5. Count empty spots (distinguished from air bubbles by their fuzzy edges and lack of reflectivity; Fig. 2.5. 2B ) with the naked eye or with a 10× dissecting microscope, moving the slide gently to prevent shaking and to avoid disturbing the monolayer. 70 % ethanol SeaPlaque low melting point agarose (FMC Bioproducts) Slides frosted at one end (e.g., Gold Seal Rite-O N slides, Fisher) Slide holders and staining cylinders (Fisher) Oven IOOml Glass Bottle 43°C water bath Slide Tray 70 % Ethanol 3inX I in X 0.93 ~ 1.05 mm slides Slide Rack and Stainer (Fisher) Dry Oven 0.25in double-sided adhesive (e.g. 3M) Roller (e.g., 25 ml pipette or similar round object) 1. Place a 3in X l in X 0.93 to 1.05m m slide on a slide rack. Transfer it to a vat of 70% ethanol for soaking. Remove from the rack and dry the slide in a dry oven for 10 m in. Then allow the slide to cool to room temperature. 2. Place 15 to 30 slides close together but not touching each other. 3. Apply 0.25in of double-sided adhesive to the ends of the slide and to the center of the slide so that the slide is divided into two 100/xl sections (Fig. 2.5.2A). 4. Peel off the back of the double-sided tape and align the other slide. 5. Gently press the slide with the roller to make the double-sided tape stick. Use a razor blade to split the tape between the slides as you use it. Bisglycinamide peptide (modified barbiturate buffer) l X M B B 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid (T N B S), sodium salt O .28mol/L dimethylarsenate buffer, p H 6. 9 IX and IOX Hanks Equilibrium Salt Solution (HBSS), magnesium free (Life Technologies), 4°C For more product details, please visit Aladdin Scientific website.
![备 选 方 案 1 改 良Jerne»Nordin PFC测定法用于型特异性反应 Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基本方案 2 ) 可 以 改 良以测定除I g M 以 外 的 其 他 Ig 类型。为达到这个目的，先按照Jem e-N ordin P F C 测定法步骤 1〜4 进行。然后，在加 有 T N P -S R B C 的玻璃管里加入50M 1稀释的羊抗IgM (如 1 : 1 0 0 ; 凭经验决定） （步骤 5 ) 以抑制I g M 的检测。同时，加 入 50/xl稀 释 的 （如 1 : 2 0 0 ; 凭经验决定）兔对需要 测 定 的 Ig同 型 （如 I g G K IgG2、 IgG3 或 IgA) 的抗血清。检 测 1 或 2 张玻片然后加工 玻 片 （步 骤 6〜10) 。 于 37°C培 养 90〜120m in。 加入豚鼠补体完成测定（步 骤 12〜16)。 备 选 方 案 2 改 良JernundefinedNordin PFC测定法用于测定多克隆抗体反应 除了测定特异同种型的反应（见备选方案1 ) 夕卜， Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基 本 方 案 2 ) 也可以被改良测定多克隆抗体反应。这种方法利用葡萄球菌A 蛋白结合兔抗 体的能力以及相对容易得到的兔源性抗小鼠I g 同种型。分泌的抗体可以接合于连接在 蛋 白 质 A 的兔抗同种型抗体上，整个复合物能固定补体从而溶解R B C 。 为完成这个方法，用氯化铬包被蛋白质A 于 S R B C 上 （见 辅 助 方 案 4)。如前所述 准 备 玻 璃 管 （见基本方案2 , 步 骤 1〜4)，但 只 是 在 43°C 水浴的条件下每管加入300/xl 琼 脂 糖 （步 骤 4)。然 后 准 备 玻 璃 管 （步 骤 5)，但 不 是 将 50]ul T N P -S R B C 分配到管中 (步骤5)，而是加入30〜4〇 4蛋白质A - SRBC (即作为靶细胞使用）。加 人 50/^1 (凭经 验决定）稀 释 的 兔 抗 I g M 、 I g G 或 I g A 同种型。检 测 玻 片 （步 骤 5)，颜色应为淡红。 再 加 人 细 胞 （步 骤 6)，但是只使用10〜20/xl来源于洗涤过的细胞板中的细胞，因为多 克隆反应通常比抗原特异性的反应强。完 成 剩 余 的 步 骤 （见基本方案2 , 步 骤 6〜16)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469497214183qbe8q7qa9zpng_small.jpg)
![涂 料 刷 （可选） 玻片盒 1 . 将一端磨砂的载玻片放在玻片盒上。将它转移至含7 0 % 乙醇的染色缸中浸泡。移出 架子在烤箱内放置IOmin使玻片干燥。将玻片冷却至室温。 2 . 在 IOOml玻璃瓶中制备1.6% (m /V ) 低 熔 点 琼 脂 糖 溶 液 （每 20m l 水 里 加 入 0.32g 琼脂糖）并摇晃。 3 . 用微波炉加热玻璃瓶，使琼脂糖沸腾20s 以确保所有琼脂糖都溶解。将琼脂糖瓶放 在 43°C 水浴中。 4 . 将玻片放在玻片盒上，磨砂的一面向上。 5a. 用 涂 料 刷 制 备 玻 片 ：用 21.3m l 温 水 稀 释 2. O m l 的 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) 制备 0 . 15%琼脂糖。用涂料刷将0 . 1 5 % 的琼脂糖包被在玻片上，将玻片放于玻片盒中。 5b. 通过浸没制备玻片：将 玻 片 放 在 玻 片 盒 内 ，浸 泡 至 含 200ml 0 . 1 5 % 琼 脂 糖 [即 181. 25m l 温水中含18. 75ml 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) ] 的染色缸中lmin。 6 . 在干烤箱内干燥玻片至少60min。将玻片冷却并保持在玻片盒里。包被的玻片可以 在室温中保存几个月](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469497235977cs2g3yvizipng_small.jpg)
![3 . 将 13. 3mg氯化铬溶解在IOml生理盐水里制备新鲜的IOX氯化铬储存液。 1 •• 10稀 释 成 I X 溶液。向蛋白质A 和 SR B C 混 合 物 中 （步 骤 2 ) 逐 滴 加 入 5. Oml I X 氯化铬 (III) 并不停轻摇离心管。在摇床上轻微摇动并于室温培养lh。 4 . 将离心管充满生理盐水， 4°C ， 80(^离 心 5min。 用 15m l生理盐水通过离心洗涤蛋白 质 A 偶 联 的 SR B C 两次后用生理盐水重悬至终浓度1 5 % 如果在偶联之前 或之后甚至3 次洗涤的上清都呈红色或淡红色，则应丢弃该SRBC， 重新使用新鲜的 (不超过几周） SRBC。 蛋 白 质 A -S R B C 可以保存在4°C 长 达 48h 。 辅 助 方 案 5 制 备 TNundefined ■卵白蛋白 此方法可用于将T N P 家族偶联至多种其他蛋白质，包 括 K L H 、 B S A 及人或牛免 疫球蛋白7 。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 卵 白 蛋 白 （Sigma-Aldrich) V 〇 .l m 〇l/L 碳酸氢钠溶液 T N B S I X 生理盐水 锡箔纸 注意：本单元的计算假定l .O m g /m l卵 白 蛋 白 的 O D 28。为 0.587, T N B S 的摩尔消 光系数为 1. 25 X IO 4N T 1 • cm — \ 1 . 用 L O m l 的 0. lmol/L 碳酸氢钠溶液溶解20m g 的 卵 白 蛋 白 （43 000g/mol)。 2 . 用 L O m l 水溶解 15m g T N B S (293g/mol) 制备 51.2mmol/L 溶液。 3 . 向 2.5m l卵 白 蛋 白 溶 液 （步 骤 1 ) 缓慢加入0.317ml T N B S 溶液并不断搅拌使TNBS 比卵白蛋白多13倍 。覆盖锡箔纸，轻轻摇荡4°C 过夜使反应发生。 4 . 用 2L 盐水透析反应物5 遍 。 5 . 测 定 O D 28q和 O D 34 q 。校 正 O D 28。得 出 T N P 族的吸光率： O D 28。校正= O D 280- O.337X O D 340 6 . 用每毫升的毫克数计算卵白蛋白的浓度： 卵 白 蛋 白 （m g /ml) = O D 28 q校正/0.587 7 . 用每升的摩尔数计算卵白蛋白的浓度： [卵 白 蛋 白 ]= 卵 白 蛋 白 （m g /ml) /43 000 8 . 用 mol/L 计 算 T N P 的浓度： [TN P] = O D 340A .25 X IO 4 9 . 计 算 T N P 和卵白蛋白的比率： T N P /卵 白 蛋 白 =摩 尔 TN P /摩尔卵白蛋白](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469497302616jj2niz9kp8png_small.jpg)
Supplementary Option 6 Purification of resting B cells by Percoll gradient centrifugation Material
