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Protocols

Detection of T-cell killing function

· Reviewed · Published · Updated · 8 min read
Summary

The assay of T-cell killing function can be applied to (1) immune cell function determination (2) clinical immunodiagnosis.

Operation method

Detection of T-cell killing function

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Protocol 1 Anti-CD3-induced T-cell killing assay Material 靶细胞： E B 病 毒 （E B V ) 转 化 的 B 淋 巴 母 细 胞 （A T C C : # 1 6 1 2 ; 单 元 8. 16) n/ R P M I -5完全培养基 lmCi/ml Na2 [51Cr] O 4 (51 Cr^ 3 0 0 mCi/mg； Amersham) ' T 细 胞 （效 应 性 细 胞 ）：单 个 核 细 胞 、 T 细 胞 或 T 细 胞 亚 群 （单 元 8 . 3 或单元 7. 2)，来自正常非免疫个体 抗 CD3 抗 体 （IgG2a) ，由 OKT3 腹 水 或 培 养 上 清 纯 化 （单 元 1 . 5 ) 或 商 品 化 试 剂 (Ortho Diagnostic 或 Becton Dickinson) 2 % (V /V ) Triton X-100 2 4 孔平底细胞培养板（Costar) Sorvall离心机及 HlOOOB转 子 （或替代品） 9 6 孔圆底细胞培养板 （Costar) 1 . 在 2 4 孔 板 各 孔 中 加 入 5 X IO5E B V 转 化 的 B 细 胞 ，补 充 RPMI- 5 完全培养基至 I .9ml。 再加入 0•Iml 51Cr (IOOjuCi) ， 37°C标记 18〜24h。 2 . 收集标记后的B 细胞并加入离心管中。加 入 IOml R P M I -5完全培养基，室温， 250g 离 心 5min，洗涤细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞（附 录 3 0 。用 R P M I -5完全培养 基 ，调整浓度至5X 103个细胞/50/^1 (即 I X l O 5个细胞/ml)。 3•从IX lO 5个细胞/IOOmI 开始，用 R P M I -5完全培养基，将 效 应 性 T 细胞进行至少 4 个浓度的系列稀释，起始效应细胞：靶 细 胞 （effector : target， E : T ) 为 20 : 1。 4•从4Mg/m l 开始，用 R P M I -5完全培养基，将 抗 C D 3 抗体进行至少5 个浓度的4 倍系 列稀释。 5 . 在 9 6 孔板各孔中，加 入 50^1放射标记的靶细胞、 50^1不同稀释度的抗C D 3 抗体和 I O O W 不同稀释度的效应细胞，各 组 设 3 复孔。自发释放对照组只加入靶细胞（不加 抗体及效应细胞）。使用单个核细胞进行实验时，应设置含靶细胞和效应细胞的对照 组 （不加抗体），即 N K 细胞杀伤活性对照组。在 另 一 块 9 6 孔板中，设置最大释放 对照组，其 中 加 入 5 \ 1 0 3标 记 后 靶 细 胞 和 150/^12%1^1〇111-100，也 设 3 复 孔
250g 离 心 2m i n 后 ，将培养板置培养箱孵育4h 。 6•将培养板200g 离 心 5min。用移液器从各孔中吸取100M1上 清 ，或用自动收集仪收集 细胞培养上清。然 后 用 7 液闪仪检测上清的cpm值 。结果计算如下： .100X (实验组一自发释放） 特异杀伤率 最大释放一自发释放 其中，自发释放为自发释放对照组的cpm值 ；实验组为待测孔c p m 值 ；最大释 放 为 含 Triton孔 的 cpm值 。确保自发释放cpm值< 2 5 % 最大释放值。使用单个核细 胞实验时，实 验 组 cpm值应减去无抗体组的cpm值以消除N K 细胞的影响。 基 本 方 案 2 抗原诱导的特异性T 细胞杀伤功能的检测 附 加 材 料 （其他材料见基本方案 1) 合成的病 毒 抗 原 肽 （推荐使用） M E M 非 必 需 氨 基 酸 （JRHBioscience) 含流感病毒的鸡胚尿囊液（H A 滴 度 1 : 128或以上），无 支 原 体 污 染 （如 A /H K /; A T C C # V R 544 或 A /J A P /305; A T C C # V R 100) 含 5 % (V7 V ) FBS 的 PBS (附录 1) 流感病毒免疫后志愿者特异性T 细胞，间 隔 采 血 （单 元 8. 2 和 8. 3) 6m l细胞培 养 管 （Falcon) 1• 将 靶 细 胞 （E B V 转 化 的 B 细胞）用51C r 标 记 （见 基 本 方 案 1 ，步 骤 1)。或者 ，用合 成的病毒抗原肽冲击E B V 转 化 的 B 细胞 。方法如下：在 转 化 的 B 细 胞 中 加 入 1〜 10/xg合成肽，然后加入51C r , 标 记 18〜24h 后直接进入步骤4 。 2•将标记后的靶细胞加入6m l 细 胞 培 养 管 中 （I X l O 6〜 3 X 106个细胞/管）。室 温 ， 2 5 0 心 离 心 5min，弃上清。加 入 0.5m l 含 I X M E M 非 必 需 氨 基 酸 的 R P M I -5完全 培养基重悬细胞，再 加 入 0.1m l 病毒感染尿囊液。同时设置未感染尿囊液的阴性对 照组。培养管置37°C 水 浴 30min。 3•加入10m l 5 % F B S 。室温， 250g 离 心 5min，弃上清。用 5m l R P M I -5重悬细胞。培 养 管 置 37°C 水 浴 5h 。 4•加入5m l 5 % F B S 。室温 ， 250g 离 心 5min，弃上清。用 l m l R P M I -5重悬细胞。台 盼蓝拒染法计数活细胞（附 录 3 0 , 用 R P M I -5完全培养基调整细胞浓度至5 X IO3 个细胞/0. lml。 5•将效应性T 细 胞 稀 释 后 （见基本方案1 ，步 骤 3)，进行杀伤功能检测。实验组和各 对照组设置、上清收集及检测同前（见基本方案1 ，步 骤 5 和 6)。

Common Problems

This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide" by J.E. Colligan et al, translated by Xuitao Cao et al.


For more product details, please visit Aladdin Scientific website.

https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments

Da — when not otherwise indicated, molecular weight units are daltons.   Mw — weight-average molecular weight.   Mn — number-average molecular weight.

Products are supplied for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.

Cite this article

Aladdin Scientific. "Detection of T-cell killing function" Aladdin Knowledge Base, updated 24 dic 2024. https://www.aladdinsci.com/us_es/faqs/detection-of-t-cell-killing-function-en.html
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