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Laboratory Protocols & SOPs Library

B Early events in lymphocyte activation

· Published · Updated
Summary

Author: J.E. Colligan et al, Translator: Xuitao Cao et al, This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".

Operation method

B Early events in lymphocyte activation

Move

Basic Scheme I BCR-induced intracellular calcium changes in B cells Materials 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 7 〇 ^ 溶 液 ， 4°〇 V Hanks 平 衡 盐 溶 液 （HBSS) / 5 % (V /V ) FBS V 含 1 0 % (V /V ) FBS 的 IF12 或 R P M I 培养基 D M S O ，无水的 INDO-1 A M (也写作 Indo-I ， Molecular Probes) FITC-抗 B220 (Sigma 或 BD PharMingen) 生物素化抗B C R 和 抗 C D 19 (可选） V H B S S , 4°C L Ommol/L 伊 屋 霉 素 （ionomycin) ----译 者 注 （Calbiochem) F (ab’ ）2抗 IgM (ju 链 特 异 性 ； ICN Biomedicals) 或抗 IgD (BD PharminGen 或 Southern Biotechnology) 不含钙的培养基和I.〇mmol/L CaCl2 (可选） 12m m X 75m m 适合指定流式细胞仪的带盖的流式管 流 式 细 胞 仪 （即 B D PharMingen F A C S Vantage、 Beckman-Cowlter Cytomics F C - 500或 EPICS、 Cytomation M o -Flo或者含有能激发紫外光区的Indo-I 与可见 光 区 的 F T T C 和 P E 的激光器的任何仪器） 1 . 按 单 元 2.1所述方法制备小鼠脾细胞。每 个 脾 加 入 5m l 冰 冷 G e y 溶液于冰上处理脾 细 胞 3m i n 来裂解红细胞。 2•用5ml H B S S / 5 % F B S 漂洗细胞3 次 。用 含 1 0 % F B S 的 R P M I 或 IF1 2 培养基重悬 细胞至终浓度为IO X lO 6 个细胞/ml (任一液体可以用于整个检测）。如果需要，小 量静息的B 细胞可通过经Percoll梯度液分离纯化B 细 胞 （C P I 单 元 3. 4 ) 之后采用 抗 T 细 胞 抗 体 及 补 体 （单 元 2. 5 ) 或采用磁珠去除T 细胞来进一步纯化（可选）。 3•在50Mg INDO-I A M 加 入 5〇 4 D M S O 制 备 新 鲜 的 In d o -I溶液。通过预实验检测荷 载 1 0 0 % 细 胞 而 不 影 响 细 胞 活 力 所 需 要 的 量 ，来 确 定 其 最 佳 使 用 浓 度 （如 2 〜 10]umol/L )0 4 . 采用最佳浓度的In d o -I荷 载 B 细 胞 ，在适用流式细胞仪的带盖的12m m X 75m m 管 子 中 将 5jul In d o -I与 IO X lO 6 个细胞混合成总体积lm l。 松盖 在 37°C孵 育 30m in。
5 . 将 荷 载 Indo-I 的细胞转移到一个冰槽中。按 每 I.O X lO 6 个 B 细 胞 加 入 1.0/xg FITC- 抗-B 220 (或与藻红蛋白偶联的C D 5、 C D 2 3 或 C D 2 抗体）。在冰上孵育30min，然后 用 冷 H B S S 漂洗。用 含 1 0 % F B S 的 冷 IF1 2 重悬。保持细胞在冰上直到使用。如果 想要更强的钙信号，在设置了 F A C S 的 基 准 后 （步 骤 9)，加入生物素化的抗B C R 和 C D 19抗 体 和 5 倍的亲和素。 6 . 在 37C 水浴中加温30m l 含 1 0 % F B S 的 IF1 2 培养基。将 Indo-I 荷载的细胞、预温 的培养基，以及水浴锅带到流式细胞仪所在的实验室。 7•将IOOmI 1.0 X IO6 个 细 胞 转 移 到 另 一 个 12mm X 75m m 管 子 并 加 入 0. 9m l 预温的 IF1 2 / 1 0 % FBS。 在 37°C进行热均衡 2min。 8•设定流式细胞仪在350n m 激 发 I n d o -I并 在 405nm (FL2 ) 与 485nm (F L l) 检测荧 光 。计 算 FL2 (钙结合）与 FL l (钙非结合）的比率。 9• 检 测 背 景 紫 色 光 （405n m ) 与 蓝 色 光 （485n m ) 的 比 率 共 lmin，然 后 加 入 2/xl l.Ommol/L 伊屋霉素。将管子涡旋混匀然后检测荧光共4min (荧光值将快速升高并 达到平台期，随后开始下降。） 10. 重复步骤7 并检测背景荧光值lmin。 加 入 50Mg 抗 IgM(|u链特异性）或 抗 IgD，漩 涡混匀，并立即按步骤8 检测荧光比率共5〜8min (荧光值的升高将比使用伊屋霉 素的慢）。 11. 可选：为了区别细胞内钙释放与细胞外钙流入，细胞可釆用无钙培养基重悬以用于 研 究 （F B S 也必须透析以去除任何钙离子）。随后，可 加 入 l.Ommol/L CaCl2来观 察细胞外钙内流。 1 2 . 按 C P IM 单 元 5. 5 中 Rabinovitch的描述计算钙的浓度。
Basic Option 2 Analysis of protein tyrosine phosphorylation Materials (see Appendix 1 for items with V) V 无 血 清 IF1 2 或 R P M I 培 养 基 （单 元 3. 8) 25fxg/ml F (ab')2抗 IgM (/X链特异性； ICN Biomedicals) n/ I X P B S ， p H 7.2，含 有 及 不 含 憐 酸 酶 抑 制 剂 （艮 P 10mmol/L N a F 与 lmmol/L N a 3V O 4) ， 4〇 C V 裂 解 缓 冲 液 （见配方） B C A 蛋白测定试剂（Pierce) V 溶 于 I X T B S 丁 的 1. 5% B S A (见配方） 溶于 1. 5% B S A /1 X T B S T 的 R C 20 : H R P O (BD PharMingen、 Transduction Laboratories) 或 H R P -结合的 4G 10 (Upstate) 抗磷酸酪氨酸抗体 V l X T B S T 溶液 增强化学发光试剂盒（Perkin-Elmer Life Sciences 或 Pierce) 稳定素-P 膜 （Millipore) 染 料 木 黄 酮 （可选） 1 . 如 前 所 述 （单 元 2. 5 中基本方案1 ) 纯化去除红细胞的静息B 细胞。
2 . 于 I.5m l微量离心管内用无血清IF1 2 或 R P M I 培养基重悬细胞至浓度为25 X IO6 个 细胞/m l。 37°C静置孵育 30min。 3• 用 25/x g /m lF (&1/)2 抗 ： ^以 刺 激 静 息 B 细 胞 不 同 的 时 间 （如 0.5m in、 lm in 、 5min 及 15min) ， 刺激过程中细胞保持在37°C 。 加 入 0.5m l冰冷的含磷酸酶抑制剂的I X P B S ， p H 7. 2 终止反应。 4. 4°C ， 10 O OOg离 心 B 细 胞 lmin。用 0.5m l 不含磷酸酶抑制剂的I X P B S 漂 洗 3 次 。 用 0.5m l 裂解缓冲液重悬漂洗过的B 细胞。冰 上 孵 育 30min。于 4°C ， 12 OOOg离心 30m i n 去除裂解液中的核碎片和细胞骨架相关蛋白。 5 . 可选：根据厂家说明采用B C A 蛋白测定试剂检测蛋白质浓度。在 S D S -P A G E 胶不 同泳道中上样等量蛋白质。 6 . 按 单 元 12. 3 所 述 ，在还原条件下于1 0 % SDS-P A G E 胶中分离蛋白质。于 200V 电 压下电泳3h ，并按 单 元 12. 5 所述，在转膜缓冲液中转移到稳定素-P 膜上。 7•室温下在摇床上用I .5 % BSA/ 1 X T B S T 封 闭 膜 20m in。 8 . 室温下在摇床上用1 : 5 0 0 的 溶 于 I .5 % BSA/1 X T B S T 的 RC20 : H R P O 或 H R P - 结 合 的 4G 1 0 抗-磷酸酪氨酸抗体孵育膜40m in。 9 . 用 I X T B S T 漂 洗 膜 3 次 ，每 次 lOmin。最后一次漂洗后，按厂家说明书将膜采用增 强化学发光试剂盒中的化学发光试剂孵育。 10. 将 膜 曝 光 于 放 射 自 显 影 胶 片 数 秒 到 几 分 钟 直 到 在 M O 〜 20k D a 可见清晰的条带 (P L C -7 与 C D 21， 140k D a ; Src 激 酶 ， 50〜56k D a ; Syk 激 酶 ， 70kDa)。刺激过的 细胞将比未刺激的细胞观察到更高强度的一系列条带。 11. 用免疫沉淀方法鉴定蛋白质（单 元 12. 2)。如果需要，可 用 静 息 B 细胞重复实验来 进一步减少背景。同样如果需要， P T K 的作用可通过在木黄酮存在的情况下进行 实验来证实。
BASIC OPTION 3 Analysis of cell size and expression of B-cell activation molecules Materials (see Appendix 1 for items with V) 纯化的静息B 细 胞 （单 元 2. 5) V 含 5 % (V A O F B S 的 IF1 2 或 R P M I培养基 25|LLg/ml F (ab’)2 抗 M (IC N Biomedicals) 、 1.0Mg/m l 抗 CD40 (克隆 1C1D ; Southern Biotechnology 或 eBioscience) 或 I .Opg/ml LPS (Sigma) V F A C S 缓冲液 10/xg/ml 2. 4G 2 抗 Fe 受 体 抗 体 （B D PharMingen 或 A T C C # H B -197) ?1丁0抗鼠-1\/^(： 11类分子化0?1^]\^叫611，义§1 ^ ，或其他公司）：克隆]\110)6 (等位基因特异的）、 14.4.4 (等 位 基 因 特 异 的 ）及 M 5/114. 5. 2 (种属特异 的）， -C D 80 (小鼠特异的）、 -C D 86 (小鼠特异的）或-C D 138 (小鼠特异的）。 V l X PBS (附录 2A ) V 固 定 液 （可选） P E 标记的抗B 220抗 体 （可选）
96、 4 8 或 2 4 孔培养板 1 . 用 含 5 % F B S 的 IF1 2 或 R P M I 培养基培养纯化的静息B 细 胞 （来源于未免疫动物的 全脾细胞或去除T 细胞的脾细胞），细胞密度为 I.O X l O 6 个细胞/m l ，对 96、 4 8 及 2 4 孔培养板体积分别为0 •2m l 、 I.O m l 及 2. 0m l 。 2 . 根据所要分析的实验数目设定9 6 、 4 8 或 2 4 孔培养板的培养复孔为3 孔 。用 25Mg/m l F &1/)2抗 m、 I .0Mg/m l 抗 CD40 或 I .Ojug/ml LPS 刺激 B 细胞。 3 . 培 养 18〜96h 后收集细胞并用F A C S 缓冲液漂洗细胞。 4 . 预留一个含0.2X 106〜1.0X 106 个未标记细胞的样本。分配其余细胞使每管含0.2X 106〜1.0父106 个细胞。在台式离心机上4°(：， 40(^离心5111丨11。弃上清。 5 . 用 IOOm I F A C S 缓冲液重悬细胞，加 入 10Mg/ml 2. 4G 2 抗-F c 受 体 抗 体 （或正常小鼠、 大鼠或人IgG) 4°C 预孵 育 5min。 6 . 无需漂洗，直接加入I.OiUg FITC-抗小鼠- M H C class II (克隆M K D 6, 14. 4. 4 或 M 5/ 112.4)、 -抗 C D 80、 -抗 C D 8 6 或-抗C D 138抗体标记细胞。冰上孵育细胞30minQ 7 . 加入3.〇 1111?八〇 3缓冲液到离心管中， 4°〇， 40(^离心5111丨11。弃 上 清 。重复漂洗一 次 。用 0.5〜1.0ml F A C S 缓冲液重悬细胞。 8 . 可选：用 I X P B S 漂洗一次去除存在的蛋白质，然后固定细胞用于随后的分析。弃 上清，用 0.5m l 固定液重悬细胞。 4°C 可 储 存 1 周 。 9 . 在流式细胞仪上分析细胞（第四章）。采 用 未 标 记 细 胞 （步 骤 4 ) 来检测前向及侧向 散射光。 10. 根据前向及侧向散射光来确定活细胞并分析其F I T C 荧光。 11. 可选：如果需要，用 P E 标记的抗B 220抗体来进一步标记细胞。


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Explore topics: Immunological experiments

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Products are supplied for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.

Cite this article

Aladdin Scientific. "B Early events in lymphocyte activation" Aladdin Knowledge Base, updated 2025. 6. 9.. https://www.aladdinsci.com/us_ko/faqs/b-early-events-in-lymphocyte-activation-en.html
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