ECL Plus

Cat. No.: E266188

Storage

A conserver à 2-8°C,A l'abri de la lumière,Desséché

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Glace humide

Vue d’ensemble

La solution luminescente ECL Plus ultra-sensible est utilisée pour détecter les anticorps qui marquent directement ou indirectement la peroxydase de raifort HRP et ses antigènes associés. La HRP peut être utilisée pour obtenir une détection de faible niveau (picogramme) sur western blot.

(1) Un facteur de dilution d'anticorps plus élevé (1:2000～1:10000) peut être utilisé, ce qui permet d'économiser énormément d'anticorps.

(2) Simple et facile à utiliser - peut remplacer les substrats luminescents ECL d'autres sociétés, et les étapes de l'opération n'ont pas besoin d'être spécialement optimisées

(3) Sensibilité plus élevée : peut détecter des protéines de faible picogramme

(4) Durée du signal plus longue : le signal lumineux dure jusqu'à 5 heures

(5) Plus de méthodes d'imagerie - convient pour les films à rayons X, les CCD ou les imageurs laser

(6) Le prix est plus économique

Application

Le Western Blot pour les anticorps marqués à l'HRP et l'hybridation d'acides nucléiques pour les sondes marquées à l'HRP.

Mode d'emploi

1. Effectuer les procédures habituelles de SDS-PAGE, de transfert et de Western Blot. Noter l'utilisation de lgG marqués à la HRP ou de la méthode de clip anticorps primaire-streptavidine-biotine-HRP.

Vue d'ensemble des opérations

Remarque : optimiser la concentration de l'antigène et de l'anticorps. La dilution d'anticorps recommandée doit être utilisée pour garantir un résultat positif.

1) Diluer la concentration de l'anticorps primaire à 0,05～1ug/ml

2) Diluer la concentration de l'anticorps secondaire à 0,005～0,04ug/ml

3) Mélanger les deux composants du substrat dans un rapport de 1:1 pour préparer la solution de travail du substrat.

Remarque : L'exposition à la lumière du soleil ou à toute autre lumière forte peut endommager le liquide de travail. Pour obtenir les meilleurs résultats, conserver ce liquide de travail dans un flacon ambré et éviter toute exposition prolongée à une lumière forte. Une exposition de courte durée à l'éclairage habituel du laboratoire n'endommagera pas le liquide de travail.

4) Incuber le blot dans la solution de travail du substrat ECL pendant 5 minutes.

5) Aspirer l'excès de réactif. Couvrir la membrane de blotting avec un film plastique propre.

6) Exposer le film du blot sur un film radiographique.

2. Préparer fraîchement la solution de travail luminescente lors du dernier lavage de la membrane par Western Blot : Prendre des volumes égaux de solutions A et B respectivement, et les mélanger dans un récipient propre. Il est recommandé d'utiliser la solution de travail immédiatement, elle peut encore être utilisée après quelques heures à température ambiante, mais la sensibilité est légèrement réduite.

3. Retirer la membrane à l'aide d'une pince, la placer sur le papier filtre et égoutter la solution de nettoyage à sec, mais ne pas laisser la membrane sécher complètement. Le film est complètement immergé dans le liquide de travail luminescent (0,125 ml de liquide de travail luminescent/cm2 de film) et entièrement en contact avec le liquide de travail luminescent. Incuber à température ambiante pendant 3 minutes, prêt à être pressé et exposé immédiatement. Un temps d'incubation trop long n'augmente pas la sensibilité et provoque parfois des bandes d'exposition anormales. L'essence du processus de luminescence est une réaction enzymatique. L'utilisation d'une quantité insuffisante de liquide de travail pour la luminescence aura un effet négatif sur le déroulement de la réaction et entraînera également une exposition inégale des bandes sur le film et une réduction significative de la sensibilité. Afin d'atteindre l'objectif d'économie, le film peut être coupé en petits morceaux, mais il ne faut pas réduire la quantité de liquide luminescent.

4. Utiliser des pinces pour prendre le film et le placer sur le papier filtre pour drainer la solution lumineuse de travail. Ne pas laver le liquide luminescent.

5. Ouvrir la cassette de films radiographiques et étaler un film de conservation frais d'une surface plus grande que le film sur la surface intérieure de la cassette. Placer le film Western Blot sur la pellicule plastique, plier la pellicule plastique pour envelopper complètement le film Western Blot, éliminer les bulles et les plis, et couper l'excédent de pellicule plastique sur les bords. Utiliser du papier filtre pour absorber l'excès de liquide de travail luminescent. Fixer le film de conservation frais recouvrant le film Western Blot dans la cassette à l'aide de ruban adhésif, la bande de protéine étant orientée vers le haut.

6. Presser le film radiographique dans la chambre noire et l'exposer pendant une durée variable, de quelques secondes à plusieurs minutes. Développez et rincez. ,

Stocker

Conserver à 4℃ scellé et à l'abri de la lumière pendant plus d'un an. Peut être placé à température ambiante pendant une courte période.

Sécurité

Pas de toxicité particulière, à traiter comme des produits chimiques courants.

Précautions

(1) Les étapes 1 à 5 peuvent être effectuées sous une lampe fluorescente ; cependant, la sensibilité peut être légèrement réduite lorsque le liquide luminescent est exposé à une lumière forte pendant trop longtemps, et cela peut être évité en se déplaçant dans une chambre noire. Le port de gants permet d'éviter de laisser des empreintes digitales sur la membrane.

(2) Une exposition de longue durée ou un excès de protéines approfondit l'arrière-plan et fait perdre la relation linéaire entre l'intensité des bandes. Une sous-exposition rendra les bandes floues.

(3) Les bandes sur la membrane brillent après une incubation d'environ 3 minutes dans la solution de travail luminescente. La bande luminescente forte est visible à l'œil nu dans la chambre noire, et la bande luminescente de la protéine de faible abondance est faible ou même invisible à l'œil nu, mais elle peut être exposée à un film à rayons X. La durée d'émission de lumière de la bande ne peut pas être supérieure à celle de la bande luminescente. La durée d'émission de la lumière de la bande ne peut pas être jugée par simple observation visuelle. Une fluorescence invisible à l'œil nu peut en fait durer plusieurs heures et sensibiliser le film radiographique, de sorte que les bandes faibles peuvent être exposées pendant 1 à 10 heures. Si la bande n'est pas bonne après l'exposition, laver la membrane avec un tampon de lavage, réincuber l'anticorps secondaire, puis éclairer à nouveau et exposer avec l'ECL.

(4) La solution luminescente ultrasensible étant extrêmement sensible, il est fortement recommandé que la concentration initiale de la plupart des anticorps importés soit de 1:1000～1:4000 pour l'anticorps primaire et de 1:2000～1:5000 pour l'anticorps secondaire. Une concentration d'anticorps trop élevée entraînera un bruit de fond important ou l'absence de bandes, ce qui conduira à un échec.

(5) Certaines pellicules plastiques peuvent éteindre la fluorescence lorsqu'elles enveloppent la membrane de blotting ; il convient donc de choisir des pellicules plastiques de haute qualité.

(6) Un marqueur protéique pré-coloré et une étiquette d'exposition à l'autoradiographie par fluorescence peuvent être utilisés pour déterminer avec précision la position et la taille de la bande sur le film.

(7) Le NaN3 peut inhiber l'activité de la HRP. L'utilisation de NaN3 doit être évitée lors de la récupération de l'anticorps secondaire. Si nécessaire, n'utilisez pas plus de 0,01 %.

Specifications

Conditions de stockage de stockage

A conserver à 2-8°C,A l'abri de la lumière,Desséché

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Glace humide

Propriétés chimiques et physiques

• Sensibilité: light sensitive