🌎 Ship to: United States
Toggle Nav
Cart
Search
Same-day shipping on all in-stock items.
Advanced Search
Quick Order SDS CoA
Menu
Account
Settings
྾
224,000+ research products · Triple ISO certified · COA & SDS available for every product · Same-day shipping on in-stock items
Protocols

B Assays of cellular function

· Reviewed · Published · Updated · 8 min read
Summary

Author: J.E. Collier et al, Translated by Xuedao Cao et al. This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".

Operation method

B Assays of cellular function

Move

Basic Scenario 1 Antigen-specific antibody production Material 年轻的无病原体的成年小鼠 V IF1 2 完全培养基或者R P M I 培 养 基 （见配方） 无菌抗原： 1〜10/xg/ml TNP- L P S (Sigma-Aldrich) T N P - B A (同上） 1〜20ng/ml T N P - Ficoll (BioSearch Technologies; T N P - A E C M Ficoll) 荚膜肺炎球菌多糖： Pneumo Vax (Merck) 或 者 Pnu-Imune (Lederle) 疫苗或 者纯化的肺炎球菌多糖（A T C C 号 169-X ) 1〜2(Vg/ml T N P - O V A (见辅助方案5) 0 •01 % 〜1% V7V S R B C (Colorado Serum) V H B S S 或 生 理 盐 水 （可选） 带有防蒸发盖的9 6 孔 Costar平底微量滴定板 4 8 孔 平 底 板 （Corning) 带微量培养板套桶的冷冻低速离心机 1 . 根据需要制备脾脏或者淋巴结细胞，或 者 纯 化 的 初 始 （单 元 2. 2 ) 或 抗 原 刺 激 的 B 细 胞 （3〜4 周前用抗原或半抗原：载体免疫过的小鼠）、 T 细 胞 （Miirphy ^ W .， 1 9 90)和 巨 噬 细 胞 （单 元 6.1)，并 将 其 悬 浮 在 IF1 2 完 全 培 养 基 或 者 R P M I 培养基 中。计 数 （如使用血细胞计数器，附 录 3A )。 从载体致敏的小鼠或特异性T 细胞受体转基因小鼠获得的T 细胞用于体外刺 激 。 D O 11.10T 细胞受体转基因小鼠可用于对T N P -O V A 的反应，因为它们的T 细 胞受体能特异性识别卵白蛋白多肽（M u r p h y 衫W .， 1990)。活化 的 B 细胞将产生更 高背景的应答。产生良好的反应需要巨噬细胞或树突细胞的存在。对 于 T 细胞依赖 的反应， T 细胞克隆可以取代来源于抗原冲击过的或T C R 转基因的小鼠的T 细胞。 该克隆的T h l 或 T h 2 类型可能影响抗体的亚型。 2a•对于带防蒸发盖的9 6 孔 Costar平底板：调 整细胞浓度至100/xl培 养 基 含 IO5〜IO6 个细胞。 2 b. 对 于 4 8 孔 Costar平 底 板 ：调 整 细 胞 浓 度 至 5 0 0 M 1 培 养 基 含 0. 5 X IO6 〜 2 X IO6 细胞。 3 . 准备抗原稀释液的时候将细胞置于冰上，然后加入板中。当应用多克隆反应或者使
用 TI-I 抗原的时候使用较低的细胞密度，当 使 用 T N P -Ficoll、 S R B C ，其 他 T 细胞 依赖抗原的情况下使用较髙的细胞密度。 使用纯化的B 细胞时， T 细胞可以按照T 细胞/B 细 胞 为 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1. 0 的比例滴定。如果需要， T 细胞可以用抗原或者抗C D 3 抗体预先活化。 巨噬细 胞按照巨噬细胞/B 细胞为0.1、 0.2、 0.5和 1.0的比例滴定。太 多 的 T 细胞或者巨 噬细胞能抑制B 细胞的活化。如果没加T 细胞或者巨噬细胞，可以向胸腺非依赖性 抗原活化的B 细胞加入细胞因子IL-4 和 IL-5联 合 ，或 者 IL-I 和 IL-6。在 加 入 IL-4 和 IL- 5 时，可以联合加入IL-2也可以不加入IL-2。 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5和 IL-6 可 以 购 于 R & D 公 司 。另 外 ，少 量 IL- 1 和 IL- 2 可 以 从 N I H Biological Response Modifiers Program 获得。 IL-10 可以由 Schering Plough 购得。 用于培养的活细胞的比例要介于9 0 % 〜9 5 % ，以获得较好的反应（附 录 3C )。 4 . 在 纯 化 B 细胞的时候，根据实验设计，在超净台中制备无防腐剂的抗原，并将其稀 释至加入每孔后终浓度符合以下要求， 9 6 孔 板 每 孔 加 入 50〜100M1 (终培养体积为 每 孔 200M1)， 4 8 孔板每孔加入250〜500M1 (终培养体积为每孔I.Oml) : 1〜10Mg/ml T N P - LPS 1 ： 100 T N P - B A 1〜20ng/ml TNP-Ficoll 0. 05〜5ng/ml荚膜肺炎球菌多糖 1〜20|Ltg/ml T N P - O V A 0.01 % 〜1% (W ) S R B C 0.1〜IOjUgAnl含 C P G 基 序 的 寡 核 苷 酸 （多克隆活化） 每孔不能加入多种抗原。 5a. 对 于 9 6 孔板 ：加 入 100/xl细 胞 稀 释 液 （步 骤 3 ) 至内孔中。用培养基、 H B S S 或者 生理盐水充满外孔。 5b. 对 于 4 8 孔 板 ：加 入 5 0 0 0 细 胞 稀 释 液 （步 骤 3 ) 至需要测定的孔中。 6 . 培 养 4〜5d 。当进行P F C 检 测 时 （见基本方案2)，省略下面的2 个步骤，并在收获 细胞之前建立好所有的测定条件。如果用于E L I S A 测 定 （单 元 1.2)，则进行下面所 有的步骤。 7 . 如果 做 E L I S A 测定，测 定 2d 前 用 200/xl完全培养基洗涤细胞去除可溶性抗原。在微 量培养板离心机里4°C ， 170g 离 心 5〜IOmin以收集细胞。之后颠倒平板，抖动手腕 甩去上清。在灭菌纱布上轻拍。如果用来刺激反应的抗原不干扰E L I S A 检测，则可 跳过步骤8 和 9 , 从培养体系中收集上清。 8 . 向 9 6 孔板内每孔加入完全培养基200^x1或 者 4 8 孔板内每孔加入500M1。按 照 步 骤 7 离心弃上清。重复该步骤2 遍 。 9a. 对 于 9 6 孔板 ：用 200M1培养基重悬细胞后培养24〜48h 。收 集 15(^1上清并保持冷 冻状态直到测定。 9b. 对 于 4 8 孔板 ：用 SOOiUl培养基重悬细胞后培养24〜48h 。收 集 4 0 0 4 上清并保持冷 冻状态直到测定。 10.按 照 步 骤 7 和 8 洗涤细胞，去除上清之后，在吸水纸上轻轻拍去残余上清。加入

Cells were resuspended in 200ul complete medium (both plates). Place the cells on ice before the assay.

Base case 2 Jerne-Nordin PFC assay Material

2 X R P M I 1640 medium with bicarbonate (Invitrogen)

SeaPlaque low melting point agarose (F M C BioProducts)
T N P - S R B C (见辅助方案3) 膝 鼠 补 体 （Colorado Serum) V D P B S 0.85% (m /V ) NaCl (如生理盐水） 43°C 水浴 12m m X 75m m 硼 硅 玻 璃 管 （Fisher) 琼脂糖包被的玻片（见辅助方案1) 纱布 V 玻片托盘，自 制 （图 2.5.1) 〇 〇 〇 227mm 〇 50mm O 12mm ^ 〇 123mm 〇 I27mm 〇 卡槽 — ^ O B 琼脂糖/血 玻片磨砂边丨 兔补体 J Illmml 图 2. 5, I A. 玻片托盘上面观。 B. 玻片托盘侧面观。 台布 玻片架和玻璃染色缸 间接光源的低倍（I O X ) 双目解剖显微镜 注意：在 P F C 测定开始前，玻片要预先用0 . 1 5 % 琼脂糖包被，当使用半抗原偶联 的 T I 或 T D 抗 原 时 S R B C 需和相应的抗原偶联（见辅助方案）。 1•在 43°C 水浴中预热 100ml 2 X R P M I 1640。准备 I.6 % (m /V ) 低熔点的 SeaPkqne 琼 脂 糖 溶 液 （见 辅助方案1，步 骤 2、 3)。加入等体积的预热2 X R P M I 使得溶液变 成 0 . 8 % 。摇晃烧瓶充分混合后保存于43°C 水浴中。 2 . 排 列 12m m X 75m m 硼硅玻璃管于水浴中，和组织培养板中的顺序相同，确保每孔有 一个管对应。 3 . 从玻片盒中取出琼脂糖包被的玻片，一次排列5〜1 0 个 ，编号。 4 . 水浴中的每管加入400/xl琼脂糖/R P M I 溶 液 （步 骤 1)。可使用连续移液器或者可以 吸 出 2. 0〜5. O m l 的溶液的Cornwall注射器加速该步骤

5.- Dispense 50 ul of TNP-SRBC into 6 to 8 tubes. Examine 1 or 2 slides, pour the mixture onto the slide and spread it out along the edge of the tube (the slide is orange-red).

6 . Transfer IOOul of cells from the first well of the washed plate (if using polyclonal stimulant use a smaller volume, e.g., 20-50ul; if the inducer is weak use a larger volume, e.g., 120ul), blowing on the bottom of the wells several times so that all the cells are transferred to the first tube containing agarose.

7 . Remove the glass tube from the water bath, holding it firmly to prevent spilling of the contents, and mix with a mixer with a rubber pad with 2 pieces of gauze. Invert the glass tube to pour the mixture onto the first slide. Spread the agarose quickly through the mouth of the glass tube onto the glass surface.

8 . Repeat steps 6 and 7 to finish processing the 10 tubes; do not move the slides until they are dry and do not leave them surface up for too long or they will dry out. After the first 5 to 10 slides are done, place them face down on a homemade slide box.

9 . Repeat steps 5 to 8 for the remaining glass tubes and slides until all the culture has been transferred from the tubes to the slides.

10. Overlap the slide cassettes (or slide holders and staining cylinders), place another slide cassette on top, and cover with a damp cloth and a large plastic bag (the latter is optional).

11. Incubate for lh at 37°C in a CO2-free environment.

12. Dilute guinea pig reagent with DPBS (usually 48 ml of 1:20 or 1:25 diluted reagent per slide cassette), warm and homogenize (do not shake vigorously), maintain at 37°C.

13. Remove the wet cloth from the outside of the slide cassette. Flood the slide with diluted complement from one end of the slide with an IOml or 20mL pipette, keeping the tip of the pipette close to the edge of the slide to ensure that there are no air bubbles under the slide.

14. Incubate for lh at 37°C in the absence of CO2 .

15. Gently place the slides on slide holders and immerse the slide holders in a staining vat containing 0.85% (m/V) NaCl.

16. Observe the slide immediately or after storing at 4°C for several hours. The number of empty spots is counted by illuminating the agarose layer with indirect light under a low-power binocular autopsy microscope (enlarged 10 times). Empty spots appear as color circles in the SRBC layer of agarose. If particles are seen in the vacuoles, they are considered to be false vacuoles.

Basic Scheme 3 Cunningham-Szenberg PFC Assay

Proper absorption of guinea pig complement is important for this assay. Also, complement should be used immediately after lysis and not refrozen. All reagents should be used at room temperature to avoid the formation of air bubbles in the chambers. Slide chambers should be sealed with wax within 20 minutes of filling to avoid drying out.

Materials

Wax (tissue preparation grade)

R P M I or IF1 2 complete medium with additives

7.5% (V7 V ) S R B C or 15 % T N P - S R B C (see Supporting Program 3)

B cells washed from cultured cells (see Basic Plan 1)

50 % (V/V) guinea pig complement in complete medium (e.g. Life Technologies, ColoradoSerum)

120 cm2 glass petri dish

9 6-well U-bottom microtitration plate
Cunningham-Szenberg 小 室 （见辅助方案 2) 玻 片 托 盘 （如 C O 2 培养箱里面的托盘） 10倍的解剖显微镜（可选） 注意：所有的试剂都应该预热至室温以免培养中在小室内形成气泡。 1 . 用加热板在120cm2 的玻璃培养皿里熔化组织制备级的蜡。将加热板调至较低的温度 以维持蜡的熔化状态。 2 . 加 入 5〇 W (每种） 含添加物的R P M I 或 IF12完全培养基、 7 . 5 % S R B C 或 1 5 % T N P - S R B C 、从培养细胞中洗涤过的B 细胞，和完全培养基中5 0 % 豚鼠补体到9 6 孔 U 形 微量滴定板的孔中。通 过 将 S R B C 与豚鼠补体冰上孵育30m i n 以去除血清中的溶血 抗 体 （每 IOml加入大约I m l 洗涤 压 积 S R B C 或 T N P -S R B C )，这 种 S R B C 吸收过的 豚鼠补体用于实验。 3 . 将孔内成分混合并缓慢转移至Cunningham-Szenberg小室。将枪头保持在小室开口 IMin透明带 l/4in透明带 蜡封 盛有细胞/SRBC/补体混合物的玻片小室注：（白点代表空斑） 图 2.5.2 A. 玻片小室示意图。三 个 矩 形 阴 影 区 代 表 放 置 两 边 的l /4in透 明 带 。 同时如图所示安放吸管并加入混有SRBC和补体的细胞。 B. 产 生 PFC后一个完 整的玻片小室的示意图。白点代表在加入玻片小室的细胞、 SRBC和补体的混合 物所形成的薄胶里的空斑

The following is an example of a 6-well U-bottom microtitre plate (Fig. 2.5.2A).

The number of transferred cells should be adjusted to not more than 75 ~ IOOPFC/chamber.

4. Submerge them in hot wax so that both sides of the chamber are closed (step 1). Place the slides on a slide rack or on a tray in a CO2 incubator. and incubate at 37°C for 1h.

5. Count empty spots (distinguished from air bubbles by their fuzzy edges and lack of reflectivity; Fig. 2.5. 2B ) with the naked eye or with a 10× dissecting microscope, moving the slide gently to prevent shaking and to avoid disturbing the monolayer.
备 选 方 案 1 改 良Jerne»Nordin PFC测定法用于型特异性反应 Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基本方案 2 ) 可 以 改 良以测定除I g M 以 外 的 其 他 Ig 类型。为达到这个目的，先按照Jem e-N ordin P F C 测定法步骤 1〜4 进行。然后，在加 有 T N P -S R B C 的玻璃管里加入50M 1稀释的羊抗IgM (如 1 : 1 0 0 ; 凭经验决定） （步骤 5 ) 以抑制I g M 的检测。同时，加 入 50/xl稀 释 的 （如 1 : 2 0 0 ; 凭经验决定）兔对需要 测 定 的 Ig同 型 （如 I g G K IgG2、 IgG3 或 IgA) 的抗血清。检 测 1 或 2 张玻片然后加工 玻 片 （步 骤 6〜10) 。 于 37°C培 养 90〜120m in。 加入豚鼠补体完成测定（步 骤 12〜16)。 备 选 方 案 2 改 良JernundefinedNordin PFC测定法用于测定多克隆抗体反应 除了测定特异同种型的反应（见备选方案1 ) 夕卜， Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基 本 方 案 2 ) 也可以被改良测定多克隆抗体反应。这种方法利用葡萄球菌A 蛋白结合兔抗 体的能力以及相对容易得到的兔源性抗小鼠I g 同种型。分泌的抗体可以接合于连接在 蛋 白 质 A 的兔抗同种型抗体上，整个复合物能固定补体从而溶解R B C 。 为完成这个方法，用氯化铬包被蛋白质A 于 S R B C 上 （见 辅 助 方 案 4)。如前所述 准 备 玻 璃 管 （见基本方案2 , 步 骤 1〜4)，但 只 是 在 43°C 水浴的条件下每管加入300/xl 琼 脂 糖 （步 骤 4)。然 后 准 备 玻 璃 管 （步 骤 5)，但 不 是 将 50]ul T N P -S R B C 分配到管中 (步骤5)，而是加入30〜4〇 4蛋白质A - SRBC (即作为靶细胞使用）。加 人 50/^1 (凭经 验决定）稀 释 的 兔 抗 I g M 、 I g G 或 I g A 同种型。检 测 玻 片 （步 骤 5)，颜色应为淡红。 再 加 人 细 胞 （步 骤 6)，但是只使用10〜20/xl来源于洗涤过的细胞板中的细胞，因为多 克隆反应通常比抗原特异性的反应强。完 成 剩 余 的 步 骤 （见基本方案2 , 步 骤 6〜16)

Auxiliary protocol 1 Preparation of agarose-coated slides Material

70 % ethanol

SeaPlaque low melting point agarose (FMC Bioproducts)

Slides frosted at one end (e.g., Gold Seal Rite-O N slides, Fisher)

Slide holders and staining cylinders (Fisher)

Oven

IOOml Glass Bottle

43°C water bath

Slide Tray
涂 料 刷 （可选） 玻片盒 1 . 将一端磨砂的载玻片放在玻片盒上。将它转移至含7 0 % 乙醇的染色缸中浸泡。移出 架子在烤箱内放置IOmin使玻片干燥。将玻片冷却至室温。 2 . 在 IOOml玻璃瓶中制备1.6% (m /V ) 低 熔 点 琼 脂 糖 溶 液 （每 20m l 水 里 加 入 0.32g 琼脂糖）并摇晃。 3 . 用微波炉加热玻璃瓶，使琼脂糖沸腾20s 以确保所有琼脂糖都溶解。将琼脂糖瓶放 在 43°C 水浴中。 4 . 将玻片放在玻片盒上，磨砂的一面向上。 5a. 用 涂 料 刷 制 备 玻 片 ：用 21.3m l 温 水 稀 释 2. O m l 的 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) 制备 0 . 15%琼脂糖。用涂料刷将0 . 1 5 % 的琼脂糖包被在玻片上，将玻片放于玻片盒中。 5b. 通过浸没制备玻片：将 玻 片 放 在 玻 片 盒 内 ，浸 泡 至 含 200ml 0 . 1 5 % 琼 脂 糖 [即 181. 25m l 温水中含18. 75ml 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) ] 的染色缸中lmin。 6 . 在干烤箱内干燥玻片至少60min。将玻片冷却并保持在玻片盒里。包被的玻片可以 在室温中保存几个月

Supplementary Scheme 2 Preparation of Cunningham-Szenberg chambers MATERIALS

70 % Ethanol

3inX I in X 0.93 ~ 1.05 mm slides

Slide Rack and Stainer (Fisher)

Dry Oven

0.25in double-sided adhesive (e.g. 3M)

Roller (e.g., 25 ml pipette or similar round object)

1. Place a 3in X l in X 0.93 to 1.05m m slide on a slide rack. Transfer it to a vat of 70% ethanol for soaking. Remove from the rack and dry the slide in a dry oven for 10 m in. Then allow the slide to cool to room temperature.

2. Place 15 to 30 slides close together but not touching each other.

3. Apply 0.25in of double-sided adhesive to the ends of the slide and to the center of the slide so that the slide is divided into two 100/xl sections (Fig. 2.5.2A).

4. Peel off the back of the double-sided tape and align the other slide.

5. Gently press the slide with the roller to make the double-sided tape stick. Use a razor blade to split the tape between the slides as you use it.

Auxiliary Program 3 Trinitrobenzene Hemi-Antigen (TNP) Coupled to SRBC Materials (see Appendix 1 for items with V)

Bisglycinamide peptide (modified barbiturate buffer)

l X M B B

2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid (T N B S), sodium salt

O .28mol/L dimethylarsenate buffer, p H 6. 9
从同一绵羊采集的血液， < 4 周 龄 （通常从多只绵羊中筛选P F C 反应最佳和洗涤中 自发性溶血最少的S R B C ; 见基本方案3 ; 在 4°C 可 保 存 4 周 ） 15m l 刻度锥底离心管 IOml注射器和18G 针头 1•用20ml I X M B B 溶 解 12. 6m g 双甘氨肽。 2•使用之前用7m l 0.28mol/L p H 6 . 9 的二甲砷酸盐缓冲液溶解20m g 2 ， 4 ， 6-三硝基 苯 磺 酸 钠 （T N B S )。 3 . 用 IOml注射器和18G 针头将从同一绵羊来源的4. 5m l 血液转移至有刻度的15m l 锥 底离心管中，以维持储存S R B C 无菌。 4 . 往管里加入1父以33至14.51111刻度。 20〜25°〇， 80(^离心5111丨11。弃 上 清 ，轻轻吹 打重悬沉积物，重复洗涤一遍。上清如果是淡红色应该再洗涤一遍。如果第三次洗 涤后上清不清亮，则另外取新鲜的S R B C 用于研究。检 查 R B C 压积是 否 约 lml。 5 . 用 14. Oml 0. 28mol/L p H 6. 9 的二甲砷酸盐缓冲液洗涤R B C 沉淀物。 6 . 向洗涤过的S R B C 沉积物逐滴加入 T N B S 溶 液 （步 骤 2 ) 并吹打重悬。用锡箔纸覆 盖管口在室温下轻轻摇动lOmiri。 7 . 用 15m l 含刻度的锥底离心管同步骤4 加 入 8ml I X M B B 后离心。弃上清后用双甘氨 肽 15m l 洗 涤 （步 骤 1)。 8•弃上清后同步骤4 用 I X M B B 洗 涤 2 遍 。上清如果是淡黄色或淡红色应该再洗涤一 遍 （最 多 洗 3 或 4 次）。如果上清不清亮，则应另取存放时间较短的更新鲜的S R B C 用于研究。 9 . 弃上清后用锥底离心管刻度估计压积S R B C 的体积。加 入 I X M B B 制 备 1 3 % (V /V ) 或 15% S R B C 悬液分别用于 Jerne-Nordin (见基本方案 2 ) 或 Cunningham-Szenberg (见基本方案3 ) 测定。在 4°C 可以保存一周，每次用之前进行洗涤。

Supplementary Scheme 4 Protein A coupled with SRBC Material 材 料 绵 羊 红 细 胞 （S R B C ) 悬 液 （Colorado Serum) 生理盐水： 0. 15mol/L NaCl (Life Technologies) 生理盐水溶解的I.0m g /m l 蛋 白 质 A (Pharmacia或 Sigma-Aldrich) 六 水 合 氯 化 铬 （III) 15m l 锥底离心管 摇床 注意：磷 酸 盐 缓 冲 液 （P B S ) 不能在这些步骤里使用。 1 . 向 15m l 锥底离心管加入2.5ml S R B C 悬 液 。用生理盐水充满并混匀。台式离心机 4°C ， 800g 离 心 lOmin。弃上清后至少用盐溶液再洗涤2 遍 （直至上清清亮）。 2 . 估计压积体积。如 果 S R B C 压 积 小 于 0.5m l ，返 回 步 骤 1 加 大 S R B C 的用量重新开 始 。如 果 S R B C 压积大于0.5m l ，那么返回步骤1 减 少 S R B C 的用量重新开始。加入 生理盐水溶解的〇.5m l 的 I.O m g /m l 蛋 白 质 A ，轻柔混勻。
3 . 将 13. 3mg氯化铬溶解在IOml生理盐水里制备新鲜的IOX氯化铬储存液。 1 •• 10稀 释 成 I X 溶液。向蛋白质A 和 SR B C 混 合 物 中 （步 骤 2 ) 逐 滴 加 入 5. Oml I X 氯化铬 (III) 并不停轻摇离心管。在摇床上轻微摇动并于室温培养lh。 4 . 将离心管充满生理盐水， 4°C ， 80(^离 心 5min。 用 15m l生理盐水通过离心洗涤蛋白 质 A 偶 联 的 SR B C 两次后用生理盐水重悬至终浓度1 5 % 如果在偶联之前 或之后甚至3 次洗涤的上清都呈红色或淡红色，则应丢弃该SRBC， 重新使用新鲜的 (不超过几周） SRBC。 蛋 白 质 A -S R B C 可以保存在4°C 长 达 48h 。 辅 助 方 案 5 制 备 TNundefined ■卵白蛋白 此方法可用于将T N P 家族偶联至多种其他蛋白质，包 括 K L H 、 B S A 及人或牛免 疫球蛋白7 。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 卵 白 蛋 白 （Sigma-Aldrich) V 〇 .l m 〇l/L 碳酸氢钠溶液 T N B S I X 生理盐水 锡箔纸 注意：本单元的计算假定l .O m g /m l卵 白 蛋 白 的 O D 28。为 0.587, T N B S 的摩尔消 光系数为 1. 25 X IO 4N T 1 • cm — \ 1 . 用 L O m l 的 0. lmol/L 碳酸氢钠溶液溶解20m g 的 卵 白 蛋 白 （43 000g/mol)。 2 . 用 L O m l 水溶解 15m g T N B S (293g/mol) 制备 51.2mmol/L 溶液。 3 . 向 2.5m l卵 白 蛋 白 溶 液 （步 骤 1 ) 缓慢加入0.317ml T N B S 溶液并不断搅拌使TNBS 比卵白蛋白多13倍 。覆盖锡箔纸，轻轻摇荡4°C 过夜使反应发生。 4 . 用 2L 盐水透析反应物5 遍 。 5 . 测 定 O D 28q和 O D 34 q 。校 正 O D 28。得 出 T N P 族的吸光率： O D 28。校正= O D 280- O.337X O D 340 6 . 用每毫升的毫克数计算卵白蛋白的浓度： 卵 白 蛋 白 （m g /ml) = O D 28 q校正/0.587 7 . 用每升的摩尔数计算卵白蛋白的浓度： [卵 白 蛋 白 ]= 卵 白 蛋 白 （m g /ml) /43 000 8 . 用 mol/L 计 算 T N P 的浓度： [TN P] = O D 340A .25 X IO 4 9 . 计 算 T N P 和卵白蛋白的比率： T N P /卵 白 蛋 白 =摩 尔 TN P /摩尔卵白蛋白
Supplementary Option 6 Purification of resting B cells by Percoll gradient centrifugation Material

IX and IOX Hanks Equilibrium Salt Solution (HBSS), magnesium free (Life Technologies), 4°C
Percoll (Pharmacia LKB 或 Sigma-Aldrich) lm o l/L HEPES lm o l/L HCl 15m l和 50m l聚丙烯离心管 Sorvall R T 6 台式离心机和H-IOOOB转子或者等值的转子 1 . 制 备 脾 脏 细 胞 （单 元 2.1)。用 抗 Thy-1、抗 C D 4 、抗 C D 8 抗体以及兔补体去除T 细 胞 。每个脾脏用L O m l 不含钙镁的I X 冷 H B S S 重悬细胞。 2 . 如下制备 9 0 % P erc〇ll: 90ml Percoll 原液 9ml I O X 无钙镁的 HBSS Im l lm o l/L HEPES 0. 45ml lm o l/L HCl 3 . 用 冷 H B S S 制 备 2. 7m l表 2. 5. 2 中所列的各种浓度的P ercoll溶液。 表 2. 5. 2 Percol丨梯度溶液的配方 Percoir浓度/% 90% (V/V) Percoll/ml HBSSa/ml 密度/(g/ml) 70 2. I 0. 6 I. 086 65 I. 98 0. 72 I. 0815 60 1.8 0. 9 I. 074 50 I. 5 1.2 1.062 a. HBSS应该不含钙镁。 4 . 在 带 盖 的 15m l 锥底离心管里按如下顺序轻轻滴入不同浓度的Percoll溶 液 各 2. 5ml 以制备浓度梯度（从底部开始）： 7 0 % 、 6 6 % 、 6 0 % 和 5 0 % Perc〇ll。 5 . 将 1〜2m l最 多 含 I X lO 8〜2 X 108 个的细胞铺于 50% P e rco ll层上。沿着管壁缓慢加 入细胞悬液以免破坏梯度。在低温离心机内预冷20m in 至 4°C。 6. 4°C ， 1900g (3000r/min) 用带 H -1000B 转子的 Sorvall 台式离心机离心 20min。 7 . 去 除 5 0 % PerC〇ll层上面的 H B S S 和细胞，然后去除其他层，收集每个不同浓度界面 间的细胞至50m l 离心管中。 8 . 用 冷 H B S S 充满离心管并混匀以稀释Percoll。 4°C ， 300g 离 心 15min。再 用 冷 H B S S 洗涤细胞2 遍 。 运 用 此 方 法 得 到 的 位 于 6 5 % 和 7 0 % P e rco ll间 的 细 胞 是 静 息 细 胞 ，可 用 流 式 细 胞 仪 进 行 验 证 。 用 F A C S 进 行 分 析 ，静 息 细 胞 的 前 向 散 射 角 较 小 。位 于 5 0 % 和 6 0 % P ercoll上 面 的 是 活 化 的 细 胞 。位 于 6 0 % 和 6 5 % 之 间 的 大 多 数 也 是 静 息 细 胞 ，也可能 污 染 一 些 活 化 的 细 胞 ，如 果 需 要 使 用 大 量 的 静 息 细 胞 也 可 以 使 用 这 些 细 胞 。 通 常 静 息 B 细 胞 的 回 收 率 为 1 2 % 〜 2 0 % 。如 果 低 于 1 2 % ，有 时 可 以 从 整 个 脾 脏 细 胞 中 先 分 离 静 息 细 胞 ，然 后 用 抗 T 细 胞 抗 体 和 补 体 处 理 从 而 去 除 T 细 胞 。如果需 要 ，污 染 的 R B C 可 以 用 A C K 裂 解 缓 冲 液 （单 元 2 . 1 ) 或 者 G e y 溶 液 （单 元 2. 6 ) 去 除 。


For more product details, please visit Aladdin Scientific website.

https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments

Da — when not otherwise indicated, molecular weight units are daltons.   Mw — weight-average molecular weight.   Mn — number-average molecular weight.

Products are supplied for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.

Cite this article

Aladdin Scientific. "B Assays of cellular function" Aladdin Knowledge Base, updated Dec 24, 2024. https://www.aladdinsci.com/us_en/faqs/b-assays-of-cellular-function-en.html
Was this article helpful? Yes No 1 out 1 found this helpful
We use cookies to ensure the website functions properly and, where permitted, to improve your experience. You can manage your preferences at any time in Settings. Learn more in our Cookie Policy.

Shall we send you a message when we have discounts available?

Remind me later

Thank you! Please check your email inbox to confirm.

Oops! Notifications are disabled.

Privacy Policy Terms of Use Cookie Policy Terms and Conditions of Sale Sales Policy
Products are supplied to verified businesses, institutions, and qualified professionals for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.
Copyright © 2023–present Aladdin Scientific Corp. All rights reserved.