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Restriction enzyme digestion labeling genome scanning for mutation detection experiments

posted this at Jun 9, 2025 Updated at Dec 24, 2024
Summary

Today, there is a need for more effective methods in the detection of mutations in humans and other organisms caused by environmental toxins and radiation exposure. Environmental genomics studies are conducted on non-model system organisms, which requires a method that does not require knowledge of the genome sequence information of these organisms. Restriction landmarkgenome scanning (R L G S ) is a bi-directional electrophoresis (2 -D E ) analysis of end-labeled DNA fragments. A vertical large-scale 2-DE gel system has been developed and applied to R L G S . In a single R L G S profile of mouse or human DNA, approximately 2000 DNA fragments (dots) can be observed in the range of 1.0 to 5.0 kb for one-way electrophoresis and 0.2 to 3 kb for two-way electrophoresis. Theoretically, this system can detect two types of genomic alterations: (1) gain or loss of any of the three restriction endonucleases used in the study, and (2) insertion/deletion/rearrangement events. When sample preparation and electrophoresis conditions are optimized, the distribution of points from gel electrophoresis of a single DNA sample can be compared with other samples. This technique can detect 3000 D NA fragments without any probe and is therefore quite effective in monitoring mutations caused by I/D/R events in DNA fragments distributed throughout the genome. This method directly labels the DNA fragments instead of hybridizing them, so accurate information about the genome is not required. Therefore, this method can be applied to any species.

By Martin, this experiment is from "Environmental Genomics Lab Guide".

Operation method

Restriction enzyme digestion labeling genome scanning for mutation detection experiments

Move

## I. Materials

###1. Closure: repair of adventitious damage (RAD)

(1) Polymer mass genomic D N A : 330 ug/mL dissolved in T E buffer (10 m m ○l/L Tris, I

m m o l /L E D T A ， p H 8.0)。储存于 4°C (见注释 1 和 2)。 2. D N A 聚合酶 I ( 4 U/fxL) (TOYOBO, Osaka)。 储存于一20°C 。 3 . 局 浓 度 缓 冲 液 （1 0 X H B ): 0. 5 mol/L Tris-H C l ， p H 7. 4, 100 m m o l / L M g C l2, l m o I/L N a C l , 1 0 m m o l /L D T T 。储存于一20。。。 4. d C T P [a] S ， d G T P [ 〇： ] S (A m e r s h a m )，储存于一20°C 。 5_ d d A T P ， d d T T P (A m e r s h a m)， 储存于一20°C 。 6. R A D 储 液 ：混合 130 ML I O X H B ， 13JUL I mol/L D T T ， 30 fxL I m m o l / L d d A T P ， 30 I m m o l / L d d T T P ， 24 ；xL 10 m m o l / L d C T P [a] S 和 24 /xL 10 ( n m o l / L d G T P [a] S 。分装储存于一20° C 。 7•大口径吸头：切除0.2 m L 吸头约5 m m 长度。 2. 2 限制性酶切和同位素标记 1. (20 U / p L ) (T O Y O B O )。 储存于一2(TC (见注释 3)。 2. £ C0R V (20U /ML ) (T O Y O B O )。储存于一20°C (见注释 3)。 3. JVofI 添加物： 0.5 mol/L N a C U 20 m m o l / L M g C l 2, 0.065% 牛血清白蛋白 (BSA)， 0• 065% Triton X-100， 4 m m o l / L D T T 。 混合 100 |uL 5 mol/L NaCl, 20 pL I mol/L MgCl2, 65 ML 1%BSA, 6.5 10% Triton X-100, 4 fxL I mol/L D T T 和 805 fxL H20 。储存于一20°C。 4. [〇r32P ] d C T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 5. [Qr32P ] d G T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 6 . 测序酶乂《 2.0(12 11//^ ; 1 1 3 8 ， （ ：1以打1紐(1)。储存于一20。 ( ：。 7•终止液： 5 0 m m o l /L E D T A ， p H 8 , 含 5 0 % 蔗糖和〇.5 % 溴 酚 蓝 （ B P B ) 及二 甲 苯 蓝 （xylene cyan〇l, X C )。储存于室温

###2 Restriction enzyme digestion and isotope labeling



###3 Two-dimensional electrophoresis

3.1 One-way electrophoresis (1st D)

The setup required for the preparation of the gel and in situ digestion is shown in Figure 2.

用于圆盘琼脂凝胶制备和原位消化的小型仪器设备。
1•用于分离1〜5 k b 片段的第一向 电 泳 缓 冲 液（10 X Boyer buffer): I mol/L Tris, 0.4 mol/L 乙酸钠， 0.36 mol/L NaCl, 40 m m o l / L E D T A ， p H 8.15。 I. 8 L H 2O 溶解 242 g Tris， 109 g 三 水 （ 合）乙酸钠， 42 g N a C l，和 23. 4 g E D T A N a 2 • 2H 20 ，用 乙 酸 （IXbuffer 的 p H 为 8. 0 5 ) 调节 p H 至 8.15。用 0.45 硝酸纤维素膜过滤并储存于室温。 2•用于分离5〜12 k b 片段的第一 向 电 泳 缓 冲 液 （10 X marathon T B E buffer): 1.35 mol/L Tris， 0.45 mol/L 硼酸， 0.1 m m o l /L E D T A ， p H 8.8。 1.8L H 2O 溶解 327 g Tris, 55. 6 g 硼酸， 0 •74 g N a 2E D T A . 2H 20 , 用 0 •45 pan 硝酸纤 维素膜过滤并储存于室温。 3 . 琼 脂 糖 浓 缩 胶 （0.6%): 2_ 5 g 蔗 糖 ， 0_ 3 g Seakem Gold 琼 脂 糖 （ FMC)， 5 m L 相 应 的 I O X —向 电 泳 缓 冲 液 （ Boyer或 marathon TBE)，加 至 40 mL H2O 中。微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量的温水至起始重量。当温度降至 65°C ，用 0 •45 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 15 mL Falcon离心 管每管分装5 mL。储 存 于 4°C 。 4. 1〜5 k b 片段的琼脂糖分离胶（0 •9%): 10 g 蔗糖，〇• 9 g Seakem Gold琼脂糖 (F M C )， 0. 9 g Seakem GTG 琼 脂 糖 （ F M C ), 20 mL IOXBoyer 电泳缓冲液， 加水至200 mL。 微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重量。当温 度降至65°C ，用 0 •45 ^ x m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 mL Falcon离心管每管分装30 mL。 储存于4°C (见注释4)。 5. 5〜12 k b 片段的琼脂糖分离胶（ 〇.7%): I O g 鹿糖， 0.4 g Seakem G o l d琼脂糖 (F M C ) ， I g Seakem G T G 琼 脂 糖 （ F M C )， 20 m L IOXmarathon T B E 电泳缓 冲液，加水至200 mL。 微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重 量。当温度降至65°C , 用 0.45 p m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 m L F a l c o n 离心管每管分装30m L。 储存于4°C (见注释4)。 6•有双滴定管夹的固定架。 7 . 注 射 器 （I m L 和 6 m L )。 8•针 头 （10 c m 长， 1 9 目，平头） 。 9 . 三通管：配注射器。 10• 桂 胶 管 （ 内 径 3 m m 和 5 mm)。 11.去头的吸头：切 除 0.2 m L 吸头距头5 m m ，距 尾 部 分 ，配注射器用。 12•DNA分子质量标准：混 合 3 //L l k b l a d d e r (500 ng/ML ; NEB)， 3 0 fzL终止 液 ， 6 7 ML H 20 。储存于 4°C 。
3.2 In situ restricted endonuclease digestion
2 . 3 . 2 原 位 限 制 性 内 切 酶 消 化 1. B P B 溶 液 （0.01%)。储存于室温。 2 . 反应管： 36 c m 长 ，内 径 2. 7 m m 的 Teflon管 接 到 3 c m 长 的 硅 胶 管 （ 内 径 3 m m )。管上做好连续的号码标签。 3. HinfI 缓 冲 液 （10X ): 200 m m o l / L Tris-H C l ， p H 8.3， I mol/L NaCl, 100 m m o l /L M g C l 2， 10m m o l /L D T T 。储存于一2(T C 。


3.3 Two-Way Electrophoresis (2n d D )

4. 缓 冲 液 （2 0 U /fxL) (TOYOB)。储存于一20°C 。 2. 3.3 二 向 电 泳 （2n d D ) 1•剥离硅烧E S (R e p d -SilaneES， A m e r s h a m : 用于玻璃板包被的二氯二甲基硅焼 溶液)。 2 . 胶带： Scotch 3M 或其他型号。 3_ T B E 缓 冲 液 （5X ): 400 m m o l / L Tris, 445 m m o l / L 硼酸， 12.5 111111〇 1/1£0- T A 。 108 g Tris， 55 g 硼酸， 9. 3 g E D T A N a 2 . 2H 20 , 加水至 2 L 。用 0. 45 硝酸纤维素膜过滤，储存于室温。 4•甘油溶液（5 0 % ) : 等体积的甘油和水混合，储存于室温。 5 . 丙烯酰胺储存液（30%): 290 g 丙 烯 酰 胺 （99. 9 % 纯度）和 I O g i V , N '-亚甲基 双丙烯酰胺，加水至1000 mL，用 0.45 pm硝酸纤维素膜过滤，避光并储存于 4°C (见注释5)。 6 . 过硫酸铵：制备新鲜的1 0 % 溶液。 7. T E M E D /四甲基二乙胺。 8 . 水饱和正丁醇： 300 m L 正丁醇和等体积的水混合，吸取上层部分，存于喷雾 瓶 ，置于室温。 9 . 蓝色连接凝胶溶液：〇• 5 g Seakem G o l d 琼脂糖溶于100 m L 含 0. 0 5 % B P B 和 X C 染料的I X T B E 缓冲液，分装于3 个 Falcon 50 m L 离心管。储存于4°C 。 10•上样平台：塑料盘3 m m 厚 ， 33 c m X l O c m 。

###Radiation autoradiography
2 . 4 放射自显影 1 . 干胶仪： BioHRad 583或同类型设备。 2 . 滤纸： 35〇 11\43〇 11， 0.7 111111厚。 （ 层析纸>1〇. 526，八如311^(： 11， 1'〇 1^〇)。 3•塑料保鲜膜（50 c m 宽） 。 4. X 射 线 胶 片 （35 c m X 43 c m ): FujiRx-U , Kodak BioMax M S 或同类产品。 5 . 增 感 屏 （35 c m X 43 c m ): Fujifilm G R E N E X H R -12 ， Kodak BioMax M S 或同 类产品。 6. 3 5 Cm X 4 3 c m 胶片的曝光盒。 7. X 射线胶片洗片机

##2 Methods

###1. Episodic damage repair ("closure", "blocking")

3 . 1 偶发性损伤修复（“封闭”，“blocking”} 1 . 熔 化 RAD储存液，配制封闭液：每个DNA样本混合〇.3 piL DNA聚合酶I 和 1.8 pL RAD储液。用移液器轻柔混合，置 于 冰 上 （ 勿振荡） 。 2•加2.1斗 R A D 封闭液到7 斗 D N A (〜2 吨）中。用带粗吸头的移液器轻轻混 合。 16°(：孵 育 3〇 111丨 11后，再 65。 ( ：孵育3〇 111丨11(见注释1)
###2. Restricted enzymatic digestion and isotope labeling

3 . 2 限 制 性 酶 切 消 化 和 同 位 素 标 记 1•加2.1 M L JVw I ，各 I / V0Z I 和 E c o R V 。用带粗吸头的移液器轻轻吹打 (10次） ，充分混合达到完全消化。 37°C 孵 育 3h 。 2. D N A 聚合酶放射性标记补平iVof I 5'黏 末 端 （Sequenase Ver. 2.0)。制备标记 储液 ：每个反应混合 1. 6 斗 [Cr32P ] d C T P 和 L 6 M L [a-32P ] d G T P ， 0 •2 1 mol/L D T T ， 0. 3 p L Sequenase。加 3. 7 ( u L 标记储液至消化的D N A 中，移液 器混合充分。 37°C 孵 育 30 m i n 。 3 . 加 5 p L 终止液后，置 于 冰 上 （ 见注释6 ) 。 3-3 双向电泳 在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究 基 金 会 （Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划（The Biochemical H GeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶 电泳系统进行蛋白质突变体的研究，现在这 种技术被用于D N A 上。经过多次试验，我 已经在内径2. 4 m m 的 Telflon管中进行琼脂 糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发 现由于管内壁不平整，可使得在长时间的电 泳过程中，琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝 胶 由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和59 c m 0 •9 % 的 分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。 这种装置可以同时分析10个 D N A 样本。垂 直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子D N A 片段。此系统大大地减小了电泳的空间，并 降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶 的 量 （ 原来的系统每个反应需要使用Hinf I 图3 用于一向琼脂糖圆盘凝胶电泳的装 置 。 10 〇〇〇 U ，现 在 只 需 用 500 U )，因此使 R L G S 方法变得更为实用和经济 。 一 向的琼 脂糖圆盘凝胶系统和最新的大胶二向垂直电泳装置系统（10或 8 块胶）分别展示于图3 和图4。以上所有的装置都可以从Ohtsuka-Rikagaku (Hiroshima， Japan) 购置。 3.3.1 — 向电泳 3 . 3 . 1 . 1 琼脂糖圆盘凝胶的制备 —向电泳凝胶的制备过程如图5 所示。在同位素标记之前进行凝胶的制备。如果需 要研究两种类型的D N A (1〜5 k b 和 5〜12 kb)，就需要同时制备两种凝胶。对 于 5〜 12 kb D N A 片段，也可制备更软的凝胶。 1 . 在微波炉中溶解分离胶和浓缩胶，并置于70°C 加热板上保温。 2 . 将接有三通管的6 m L 塑料注射器通过3 c m 长 硅 胶 管 （ 内径5 m m ) 与制备凝胶 的持胶器连接。 . 1 2 6
###Bidirectional electrophoresis

A great deal of trial and error has gone into the development of the current procedure for the use of electrophoresis. The disc gel electrophoresis system has been used extensively in the past by the Radiation Effects Research Foundation's Biochemical Genetics Program for the study of protein mutants, and is now being used in DNA. After many trials, I have performed agarose disk gel electrophoresis in Telflon tubes with an inner diameter of 2. 4 m m and have gotten the best results. I have found that the unevenness of the inner wall of the tube allows the position of the agarose gel not to move during prolonged electrophoresis. The gel consisted of I.5 c m 0. 6 % concentrate and 59 c m 0 -9 % separator. Figure 3 shows a vertical disk gel setup. This device can analyze up to 10 DNA samples simultaneously. The Vertical Disc Gel System allows the separation of large molecular DNA fragments with high precision. This system greatly reduces the space available for electrophoresis and reduces the amount of expensive restriction endonucleases required for in situ digestion (the original system required Hinf I

3.1 One-way electrophoresis
3 . 将持胶器的底部伸人分离胶溶液I c m 深，慢慢吸人分离胶溶液至距底部57 cm 处的第一条线（ 见注释7)。 4 . 吸人后，保持约30s，再转移至有双夹的铁架台上，凝 固 lOmin。 5 . 将旋塞右转90°打开左边进口，小心移走管上带旋塞的注射器。 6 . 使用预热的带有平头针头的I m L 注射器灌分离胶至59 o n 处的第二条线。手指 轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固3min。 7 . 灌浓缩胶溶液至60. 5 c m 处的第三条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝 胶的表面平整。凝 固 lOmin。 8 . 用 I X —向电泳缓冲液充满持胶器。 9 . 通过直径为5 m m 的硅胶塞将持胶器放置于阳极槽中。 1 0 . 加 350 mL I X —向电泳缓冲液于底部槽。 11. 顶部槽置于底部槽上，并注人300 m L I X —向电泳缓冲液（ 见注释8)

3.1.1 Preparation of Agarose Disc Gels
3. 3.1 .2 电泳 1 . 每条胶上10 含 1 哗放射性同位素标记的D N A (见注释9)。 2 . 每条胶上1〇 juL D N A 分子质量标准（150 ng)。 3 . 所用样品加完后，合上顶部槽盖，并连通电极和电源。 4•恒压电泳。小 D N A 片 段 （1〜5 k b ), 130 V ， 19 h 后 140 V ， 24 h (约 5800 V • h) 直M 溴酚蓝条带迁移了 50 c m 。对于大的D N A 片 段 （5〜11 kb), 70 V 电泳1 周 （ 约 11 200 V . h ) 直至染料X C 迁 移 50 c m (见注释10)。 3.3.1. 3 原位限制性内切酶消化 琼脂糖圆盘凝胶分离的N w I /Ec0R V 消化片段需要用常见的限制性内切酶如 扭 nf I 进一步酶切成更小的片段，之后再进行如图1 的第二步分离。图 6 所示为如何 回收所需凝胶部分，图 7 为原位消化的步骤。在 Teflon管中进行酶切反应可以大大减 少昂贵的内切酶的使用量，并使操作过程更简便，重复性更好。 1 . 关闭电源，拔出电极，揭开顶盖，吸走阴极槽的缓冲液。 2 . 从阴极槽中取出持胶器。用去离子水清洗胶的底部以去除放射性同位素（ 注意 恰当处理具有放射性的废液)。 3 . 将含有D N A 分子质量标准的胶挤入50 m L Falcon离心管中。加人30 inL E B 溶 液 （ O.Sj^g/m L ) 染胶 20m i n 。 在紫外线下观察胶条并拍摄，用通明标尺来记录 各条分子质量标准条带之间的距离（ 见注释11)。 4 . 假设当分子质量标准I k b 和 5 kb D N A 分别迁移至距底部8 c m 和 38 c m 时， 距底部7 c m 和 39 c m 之间的32 c m 长 度 （ 此部分两端分别含B P B 和 X O 的 胶将用于胶内酶切（ 同理，对于大分子质量的D N A ，包 含 5〜12 k b 片段的距 底部7〜39 o n 之间的胶也用于酶切） 。在持胶器上距胶顶部7 c m 和 39 c m 处做 标记。 5•用I m L 配有去头吸头的塑料注射器吸取B P B 溶液，并缓慢通过B P B 溶液挤压 凝胶，当蓝色溶液到达第一条7 c m 线处，按 45°用手术刀切除挤出的凝胶。将 挤出的39 c m 凝胶转入装有20 m L IXHiraf I 缓冲液的 50 m L Falcon离心管 中，当 B P B 溶液到达39 c m 处 ，按 90°切断凝胶。 6•室温下在I X f f i n f I 缓冲液中平衡凝胶30m i n , 每 隔 IOmin更换缓冲液，期间 偶尔摇晃离心管。 7•将凝胶连同缓冲液转移至倾斜10°放置的托盘中。 8•在6 m L 注射器前装上去头吸头，并 用 3 m m 内径、 3 c m 长硅质套管将枪头连 到 2. 7m m 内径、 33 c m 长 的 Teflon管上。将胶条小心吸人Teflon管中，并尽 量除去凝胶中的缓冲液。 9•力600 p L 含 400 U H i n f I 和 0. 01% B SA 的 IX ffin f工缓冲液到2 m L 圆底离 心管，将溶液吸人Teflon管中，使 得 Hinf I 混合液浸没凝胶表面。 1〇 •移走注射器，用 3 c m 硅质套管将Teflon管首尾连接成环，放入尼龙袋中置于 37°C 孵 育 4 h (见注释12)
3.1.2 Electrophoresis

3.1.3 In situ restriction endonuclease digestion

3.2 Second direction electrophoresis
3. 3. 2 第二向电泳 3.3. 2.1 制胶 在第二向电泳之前至少一天准备凝胶。利用图4 所示系统可同时制备1〇 块 （33 cm 宽， 46 c m 长 和 0.8 m m 厚）凝胶。丙烯酰胺溶液有毒，在凝胶配制过程中，注意戴塑
3.2.1 Gel Preparation

3.2.2 Electrophoresis
胶手套。 1•仔细清洗玻璃胶板，用剥离硅烷处理倾斜一面的表面。 2•放好装置，并用粘胶带 （Scoth 3M ) 密封底部洞口（ 见注释13)。 3 . 在烧瓶中混合348 g 3 0 % 丙烯酰胺储存液， 504 g 5X T B E , 23.3 g 5 0 % 甘油， 15 g A P S 和 1110 g 水以制备5.15%丙烯酰胺凝胶（ I.25X T B E )。分装到两个 I L 真空烧瓶。我们发现配制试剂时，通过重量比利用量筒测量体积更准确。 这种准确性在保证电泳的可重复性方面非常重要。 4•真空泵抽出溶液中的气体，开始时操作要柔和。摇晃烧瓶，抽真空直至没有气 泡产生。 5 . 加 人 210斗 T E M E D 到 I L 丙烯酰胺溶液中，混 合 均 匀 （ 见注释14)。 6 . 从装置的底部进口通过硅质套管将凝胶溶液立即注人电泳装置中。当溶液到达 距玻璃板顶端I c m 处用夹子夹住进口处套管。 7 . 用水饱和的正丁醇封住液面（ 见注释15)。 8•聚合I h 后 ，用 I X T B E 代替凝胶上层溶液。 9 . 用保鲜膜封住凝胶的T B E 溶液，室温放置至使用。凝胶在室温下至少稳定放置 5 天。避免凝胶的顶部干掉。 3 . 3. 2. 2 电 泳 1 . 融化蓝色连接琼脂糖，将容器置于70°C 的加热板中。 2. Hinf I 消化4h 后 ，将每一个胶条挤人装有20 m L I X T B E 的 50 m L Falcon离 心管中。 3 . 平 衡 IOmin后 ，弃去缓冲液，将凝胶条转移至凝胶上部上样平台中，用尺子拉 直胶条，移至平台的边缘。 4 . 用连接琼脂糖堆积凝胶顶部至玻璃板的倾斜处。 5 . 用刮炉将胶条沿胶板滑到玻璃板上。 6 . 在胶条上覆盖足够的琼脂糖，凝 固 lOmin，移走平台。 7 . 在每个槽中加人2.5 L I X T B E 缓冲液，移除封洞的胶带，让凝胶和缓冲液 接触。 8•接通电极供电，电 泳 150 V ， 40h ，直至分子质量标准染料X C 移 至 35 c m 处 (见注释16)。 3. 3. 3 放射自显影 1 . 电泳结束后，关闭电源，拔出电极。 2 . 移走电泳缓冲液。 3 . 放平装置，拿走塑料盖板。 4 . 用刮伊缓慢撬开顶部的玻璃板。 5. 在凝胶上放置一块滤纸（35 c m X 43 c m ，比凝胶宽2 c m ) , 轻按使凝胶附于滤纸 上，用手术刀切除凝胶的3 c m 部分。 6 . 捏住滤纸的边缘，迅速翻转将凝胶覆盖于干胶器上的另外一张滤纸上（ 凝胶置 于上方)，用保鲜膜覆盖凝胶，尽量避免折痕和气泡。
3.3 Radiographic autoradiography

###4 Image analysis
图 8 所 示 为 B A L B /c 小 鼠 的 R L G S 图谱的数字图像。在此方法中，通过放射自显 影方法观察末端标记的D N A 片段。点的密度 代 表 D N A 的拷贝数目。除了来源于性染色体 片 段 和 核 糖 体 D N A 等有多拷贝的片段之外, 一 张 R L G S 图谱上的大部分点的密度代表常染 色 体 D N A 片段的两个拷贝。对基因组突变的 检 测 主 要 是 通 过 对 D N A 片 段 长 度 改 变 的 观 察 ，如 插 人 或 缺 失 或 B 切 位 点 碱 基 的 突 变 。 通过查找只出现在子代而不在亲代出现的新 的点，或 者 在 子 代 只 有 一 半 浓 度 （ 一个拷贝） 而亲代为两个拷贝的点，突变也可以得到鉴 定 。如 果 从 iV〇i I 位 点 到 最 近 的 I 或 &〇 R I 位 点 的 距 离 发 生 改 变 ，突变的片段在 凝胶上将会发生位移。突变的片段发生位移 的 情 况 如 图 9 所 示 。在 某 些 情 况 下 ，发生突 变 的 片 段 未 必 能 在 每 一 块 凝 胶 上 发 现 （ 尽管 可能出现在不同的胶上） ，如 果 Not I 位点发 2kb- 小鼠、 图谱 图 8 BALB/c小鼠RLGS图谱的数字图像。 根据克隆位点的序列信息确定每一维上的片 段大小。 生缺失或者碱基替代，那么这个点就不会出现在凝胶上。无 论 如 何 ，正常的点的密 度理论上应该减少5 0 % 。现在已有计算机程序来分析复杂的双向电泳图谱。计算机 辅助图像分析检测每个点的存在与否以及任何密度上的改变；因此，我们能高效地检测 基因组的缺失、扩增 、插人 、重组 。图 1 0 是我们在小鼠研究中检测到的基因突变的 例子。 3.5 RLGS用到的其他内切酶 内切酶iV〇«I 、 E c o R I 和 H i n f I 的组合，使我们得到了人类和小鼠（ 以及大鼠) D N A 点最平均分布的图谱。据我们的经验，目前可以用于检测人类和小鼠的最可靠的 标 记 内 切 酶 是 I (我们检测10 000块胶后得出结论） 。第 二 个 酶 （ 在标准方法中； E c o R I ) 、 PsfI (O T G C A G ) 和尸加1[ (C A G + C T G ) 也可以使用。至于第三个用 于原位消化的酶， M 6〇 I ~undefined G A T C ) 、 B c m H I (G +G A T C C )、 I 、和 P ™ n 都可 用 （ 尽 管 I 较贵） 。这些酶可以随意组合。 R L G S 在其他物种上同样适用，而且如 果研究物种的基因组比人类或小鼠小，那么操作更容易。我们已经检测了以下物种: (1) Medaka (—种鱼；基因组大小为 I X 109bp): N o f I 、 E c o R V 、和 Hinf I 组合， (2) Sacchromyces (酵母； 3X 107bp): Hiwdin (A ^A G C T T ; 作为标记内切酶，仅仅

###5 Other Endonucleases Used in RLGS
图 9 限制性图谱为等位基因位点的各种空间构象提供可能的解释。 C 标 记的片段代表常规等位基因， V I、 V2、 V3 代表突变体。标记的限制性位 点 ： N= JV toI, H= H k f I , E= & 〇RV 。阴影长方形标记代表缺失图 1 0 发生突变的部分位点的特写。箭头所指为检测到的 突变位点。突变位点用M标记。在最左栏，突变的杂合子 位点消失


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