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Detection of Nitric Oxide in Macrophages

posted this at Jun 9, 2025 Updated at Dec 24, 2024
Summary

This protocol reflects the level of nitric oxide secretion by detecting nitrite in the culture supernatants of activated macrophages (walled or non-walled) Author: J.E. Colligan et al.

Operation method

Detection of nitrogen monoxide in macrophage cells

Move

basic program Materials 小鼠腹腔巨噬细胞（单 元 6.1) D M E M - 5 : 含 5 % (W V ) 热灭活 FBS (HyClone) 的 D M E M (GIBC0 / B R L ) lmmol/L iVG 单 甲 基 乙 酸 精 氨 酸 （N G-monomethyl-L-arginine acetate， L-N M A ; Calbiochem 或 Research Biochemicals)， PBS 配制， 保存 小鼠重组7-干 扰 素 （IFN-7, Genzyme) 0111: B 4 型大肠杆菌LPS (Sigma) ，肿瘤坏死因子a (T N F -cx; Genzyme) 或其他 激活剂 2mmol/L N a N O 2 (Sigma)， D M E M -5 配制， 4〇 C 保存 V Griess 试剂 12m m X 75m m 带盖聚丙烯塑料细胞培养管（Falcon) 9 6 孔平底细胞培养板（Costar)
1 . 收 集 小 鼠 腹 腔 巨 噬 细 胞 （单 元 6.1)，用 D M E M - 5 调 整 细 胞 浓 度 至 I X IO6个细 胞/m l 。操作非 贴 壁 型 巨 嗤 细 胞 时 ：在 12m m X 75m m 聚 丙 烯 细 胞 培 养 管 中 加 入 0.5m l 细胞悬液。操作贴壁型巨噬细胞时：在 9 6 孔平底培养板中，加 入 0.1m l 细胞 悬液。如下设置实验组和对照组，每 组 2〜3 复孔： 第 1 组 ：未刺激组 第 2 组 ： IFN-7刺激组 第 3 组 ： LPS (或其他激活剂，如 TNF) 刺激组 第 4 组 ： IFN-7 和 LPS联合刺激组 第 5 组 ： 50〜25〇 iumol/L L-N M A 、 IFN-7 和 LPS 联合刺激组 2 . 操作贴壁型巨噬细胞时：将 9 6 孔细胞培养板置37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养1〜 2h ，使巨噬细胞贴壁。然 后 用 D M E M -5培养基轻轻洗涤细胞2 或 3 次。 3 . 在 第 5 组中加入L -N M A ，终浓度为50〜25(V m o l /L 。 4 . 在 第 2、 4 、 5 组中分别加入IFN-7 (使巨噬细胞致敏），终浓度均为0.1〜l 〇 U/ml。 5 . 在 第 3、 4 、 5 组中分别加入LPS (使巨噬细胞激活），终浓度均为2〜10ng/m l 。 6 . 细胞培养24〜72h 后 ，取各组上清SOiUl分 别 加 入 9 6 孔平底板中。 7 . 将 N a N O 2溶 液 系 列 稀 释 （终浓度从1〜125Mmol/L ，各 取 50M1加 入 9 6 孔平底板中）。 8•在待测孔和N a N O 2标准孔中加入50jul Griess试剂 。最 好 先 加 入 萘 乙 二 胺 （naphthylenediamine) ，然后再加入氨基苯磺酰胺（sulfanilamide)。 9 . 用酶联仪检测N a N 0 2# 准孔和各待测孔的光吸收值，测量波长为550n m 。用 N a N O 2 标准孔的光吸收值和对应的浓度做一标准曲线（在 〇 〜 范 围 内 应 呈 线 性 相关）。用此标准曲线计算出各待测样品的N 〇 2— 值 。结 果 以 N 0 2— 浓 度 值 （Mmol/L ) 或标准化换算后的N O 「 摩尔值表示，即 IO5个 细 胞 或 I m g 蛋 白 样 品 的 N O 「摩尔数 (nmol/105个细胞或nmol/m g 蛋白）。 本 方 法 检 测 N O 「灵敏 度 为 l; xmol/L左 右 。


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https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments 
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