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Protocols

Immunofluorescence and cell separation

· Reviewed · Published · Updated · 8 min read
Summary

Flow cytometry is used to analyze membrane surface antigens and intracellular antigens expressed by cells, and is capable of specifically distinguishing different cell types in heterogeneous populations, evaluating the purity of isolated cell subpopulations, and analyzing cell size and volume. The technique primarily detects the fluorescence intensity of fluorescently coupled antibodies or ligands that bind a particular cellular antigen molecule.

Author: J.E. Colligan et al, Translator: Xuitao Cao et al, This experiment is from the "Compendium of Immunology Laboratory Guide".

Operation method

Immunofluorescence and cell separation

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Basic Scheme 1 Immunofluorescent labeling of single-cell surface antigens Materials 样品：淋 巴 组 织 （单 元 2 . 1 ) 或者人外周血单细胞悬液（单 元 8.1) V 荧光标记用的缓冲液， 4°C 荧光偶联和未偶联的抗体（见辅助方案1 和 2)，已经通过滴定稀释到合适的浓度 v^ Og/m l 碘 化 丙 啶 （可选用） V 固 定 液 （可选用，使用前配制） 12m m X 15m m 圆底试管或9 6 孔圆底培养板 IOOjum尼龙网 带 有 H -1000B 的 SorvallTR-6000B 离 心 机 （或者同等可替代的离心机） 1 . 用眼科剪将淋巴组织的样品剪成小块，置小培养皿，预先加入5m l 4°C 的缓冲液，研 磨至碎。 2 . 将组织悬液移至试管，静 置 2〜3min，使粗组织块沉淀，然后将上清移至新的试管， 或经过尼龙网过滤细胞悬液至试管。 3. 4°C ， 300g 离 心 8min，弃上清。重悬细胞沉淀于IOm l 的 4°C 缓冲液中。台盼蓝拒染 法 确 定 活 细 胞 数 （附 录 3 0 。 4. 4°C ， 300g 离 心 8min，弃上清。重悬细胞于缓冲液，调整细胞终浓度至2 X 107个细 胞/ml。取 出 50M1的 细 胞 （1X 106) ，置 于 12m m X 75m m 的圆底试管，或 者 9 6 孔圆 底培养板。 5 . 在上述细胞中加入IOiUl合适浓度的荧光偶联抗体，混匀。冰 浴 20min (低亲和力抗 体需要延长时间或者提高孵育温度）。 6a. 使用试管进行标记：用 2m l 缓冲液洗绦2 次 ，每 次 4°C ， 300g 离 心 6min，弃上清。 6b. 使用培养板标记：每 次 用 IOOiUl缓冲液洗涤，共 3〜5 次 。每 次 4°C ， 500g 离 心 ， 弃上清。 对 于 间 接 标 记 ，需 要 进 行 荧 光 标 记 的 二 抗 、 生 物 素 / 链 亲 和 素 或 者 是 多 色 标 记 的 抗 体 。 每 标 记 一 种 抗 体 都 需 要 按 照 上 述 程 序 进 行 孵 育 、 清 洗 。 在 多 色 分 析 时 ， 如 果 确 认 抗 体 之 间 没 有 相 互 作 用 ， 可 以 同 时 进 行 孵 育 、 洗 涤 。 7 . 重悬细胞于400M1、 4°C 的荧光标记用的缓冲液。上机前一直放置于4°C 。 8 . 可选使用：加 入 10M1 的 50Mg/m l 的碘化丙啶，用于上机时排除死细胞。 9 . 可选使用：细胞在分析前可进行固定。但固定后的细胞，尽量保持在4°C ，时间不超 过 1 周 。
Basic Scheme 2 Immunofluorescent labeling of intracellular antigens in fixed and permeabilized single cells Materials 细胞样品：来源于人和鼠的外周血单个核细胞、骨髓细胞、胸腺和脾脏细胞；悬浮 生长的细胞或者分散的组织细胞 V 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS， 4°C V 固定液， 4eC V 渗透液 V 荧光标记用缓冲液 已经用标记缓冲液稀释到合适浓度的荧光标记的或生物素标记的，或未标记的抗体 (见辅助方案1 和 2 或使用商品化产品） 洗 涤 缓 冲 液 （简称洗液）： P B S 含 0 . 1 % T w e e n 20 (V /V ) (在棕色瓶中储存时间为 1 个月） 间接标记的荧光二抗或者生物素/链亲和素 PBS (附录1 ) 含 有 lmg/ml P I和 7-氨基放线菌素D (7-A A D 可选用，见 P I和 7- A A D 的配方） 1 % 的 多 聚 甲 醛 （m A O 12m m X 15m m 圆底试管 带 有 H -1000B 的 SorvallTR-6000B (或者同等可替代的离心机） 62p m 尼 龙 网 （可选用） 1 . 取 约 IO6个 细 胞 置 于 12m m X 15m m 圆底试管，加 入 无 Ca2+ 和 M g 2+ 的 P B S ， 4°C ， 300g•离心 5min0 如 果 有 相 当 数 量 的 死 细 胞 存 在 ， 应 该 在 固 定 和 渗 透 前 通 过 Ficoll-Hypaqiie分离 去 除 ； 或 者 应 用 荧 光 染 料 标 记 死 细 胞 ，在 流 式 细 胞 仪 分 析 时 排 除 这 部 分 细 胞 。 2 . 吸弃或者快速倾倒上清。加 入 875M1冷 ： P B S ，混匀。加 入 125^1的冷固定液，混合。 4°C 孵 育 lh。 3 . 为了保证最佳的标记效率，根据所要标记的抗原适当调整固定液的浓度和孵育时间。 4°C ， 300g 离 心 5min。弃 上 清 。加 入 I m l 渗 透 液 。混 匀 ， 37°C 赙 育 15min。加入 I m l P B S 0 4°C ， 300g 离心 5min。弃上清。 4 . 对于未标记的、荧光标记的或者生物素标记的抗体：加 入 100/xl工作浓度的抗体。 混 勻 。 4°C 孵 育 30min。 加 入 I m l的洗液， 4°C ， 300g 离 心 5min。 弃上清。再如此洗 涤一遍。如果是釆用直接标记法标记细胞，直接进行步骤5a 和步骤5b 。 对于采用间 接标记法，用未标记的抗体或者生物素标记的抗体孵育后，再通过荧光标记的二抗细胞样品：来源于人和鼠的外周血单个核细胞、骨髓细胞、胸腺和脾脏细胞；悬浮 生长的细胞或者分散的组织细胞 V 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS， 4°C V 固定液， 4eC V 渗透液 V 荧光标记用缓冲液 已经用标记缓冲液稀释到合适浓度的荧光标记的或生物素标记的，或未标记的抗体 (见辅助方案1 和 2 或使用商品化产品） 洗 涤 缓 冲 液 （简称洗液）： P B S 含 0 . 1 % T w e e n 20 (V /V ) (在棕色瓶中储存时间为 1 个月） 间接标记的荧光二抗或者生物素/链亲和素 PBS (附录1 ) 含 有 lmg/ml P I和 7-氨基放线菌素D (7-A A D 可选用，见 P I和 7- A A D 的配方） 1 % 的 多 聚 甲 醛 （m A O 12m m X 15m m 圆底试管 带 有 H -1000B 的 SorvallTR-6000B (或者同等可替代的离心机） 62p m 尼 龙 网 （可选用） 1 . 取 约 IO6个 细 胞 置 于 12m m X 15m m 圆底试管，加 入 无 Ca2+ 和 M g 2+ 的 P B S ， 4°C ， 300g•离心 5min0 如 果 有 相 当 数 量 的 死 细 胞 存 在 ， 应 该 在 固 定 和 渗 透 前 通 过 Ficoll-Hypaqiie分离 去 除 ； 或 者 应 用 荧 光 染 料 标 记 死 细 胞 ，在 流 式 细 胞 仪 分 析 时 排 除 这 部 分 细 胞 。 2 . 吸弃或者快速倾倒上清。加 入 875M1冷 ： P B S ，混匀。加 入 125^1的冷固定液，混合。 4°C 孵 育 lh。 3 . 为了保证最佳的标记效率，根据所要标记的抗原适当调整固定液的浓度和孵育时间。 4°C ， 300g 离 心 5min。弃 上 清 。加 入 I m l 渗 透 液 。混 匀 ， 37°C 赙 育 15min。加入 I m l P B S 0 4°C ， 300g 离心 5min。弃上清。 4 . 对于未标记的、荧光标记的或者生物素标记的抗体：加 入 100/xl工作浓度的抗体。 混 勻 。 4°C 孵 育 30min。 加 入 I m l的洗液， 4°C ， 300g 离 心 5min。 弃上清。再如此洗 涤一遍。如果是釆用直接标记法标记细胞，直接进行步骤5a 和步骤5b 。 对于采用间 接标记法，用未标记的抗体或者生物素标记的抗体孵育后，再通过荧光标记的二抗
或者生物素/链亲和素重复进行以上的步骤。 在 标 记 一 抗 前 l m i n ， 可 以 加 入 50jul的 人 A B 血 清 或 者 正 常 小 鼠 血 清 进 行 封 闭 ， 以 减 少 非 特 异 性 结 合 。 如 果 分 析 细 胞 表 面 的 免 疫 球 蛋 白 ， 人 A B 血 清 不 能 用 于 封 闭 。 对 于 某 些 抗 体 ， 需 要 提 高 孵 育 温 度 和 延 长 孵 育 时 间 ， 如 Ig M 类 抗 体 ， 穿 过 细 胞 膜 的 效 率 低 ， 比 Ig G 抗 体 进 入 到 细 胞 内 慢 。 5 a . 如果不进行D N A 含量测定：重悬细胞于缓冲液，浓 度 为 I X l O 6〜2 X 1 0 6个细胞/ ml。有必要的话，用 62Mm 尼龙网过滤样品去除团块。在 上 机 前 于 4°C 避光保存。 要获得最佳的结果，最 好 立 即 上 机 （2h 内）。如果要以后分析，重 悬 细 胞 于 1 % 的 多聚甲醛中。 5b. 如果同时进行胞内抗原的标记和D N A 含量测定，重 悬 I X l O 6〜2 X 106个细胞/ m l 于 含有20哗/11117-八仙，或者10哗/1111?1的？6 3 中 。 4°(：孵育3〇 111111。有必要的话，用 62Mm 尼龙网过滤样品去除团块。在 上 机 前 于 4°C 避光保存。 2h 内上机。： PI可以和 F I T C 同时使用； 7-A A D 可以和F I T C 标记的抗体和P E 标记的抗体同时使用
Supplementary Option 1 Antibody coupled with fluorescent isothiocyanate yellow (FITC) Material 1 〜 2m g / m l 的纯化单克隆抗体（单 元 1. 3) V F I T C 标记缓冲液， 4°C V 透析液， 4°C 5mg/ml F I T C 溶解于无水D M S O , 使用前配制 Sephadex G -25 (Pharmacia Biotech P D - 1 0 ; 可选用） 1 . 用 500ml F I T C 标记缓冲液在4°C 透析纯化的单抗，共 2d 。期间更换2 或 3 次缓冲液 (通常情况下， 5m l 的 1〜2m g /m l 的抗体可以用500m l 缓冲液）。在 A 28。处检测吸光 度 ，确 定 抗 体 浓 度 （= A 28。X 0.74 X 稀释倍数）。 2 . 每毫克抗体加入2 0 M 1 的 5m g /m l F I T C 。 室温孵育 2h 。 3 . 用透析液透析去除未结合的F I T C ，共 2d。期间更换2 或 3 次缓冲液。或 者 过 Sephadex G -25 去除。 4 . 用透析液稀释FITC-I g G 复合物，使 A 28()< 2 . 0 。在 A 28。和 A 492处检测吸光度，计算 蛋白质浓度。 蛋白质(m g /ml)= A 28。—(t 9:X〇 .35) I.4 是 F I T C 偶联抗体摩尔系数的倒数。 5 . 计算蛋白质的摩尔数： 蛋 白 质 (― F I T C (mol) A 492 0. 69X 10' I.5X I O 5= m o l • wt • Ig 0. 69X 105= m o l • wt • FITC

6 . Calculate the fluorescein/protein ratio (F/P ).
F/P = F I T C moles/protein moles; F/P = 5 : 1 to 6 : 1 is most suitable for flow cytometry.

Supplementary Program 2 Long Arm Biotin Coupled Antibody

Follow the FITC coupling method (see Supplementary Scheme 1), substituting the following reagents and steps as described in the Special Instructions.
Additional material (see Additional Program 1 for additional material and Appendix 1 for items with V)

V Succinimidyl ethyl ester labeling buffer
10m g /m l long-armed Biotin (Z y m e d Company) was dissolved in D M S O and prepared before use.
1 . Dialyze 1~2m g/m l of purified antibody in the same way as for FITC coupling. At the time of dialyzing, the antibody was prepared with a succinimide
Replace the FIC Labeling Buffer with Succinimidyl Esters Labeling Buffer. Determine antibody concentration by measuring absorbance at A 28.
(= A 280 X 0.74 X dilution).
2 . Add IOm I of lOmg/m l of long arm biotin prepared in anhydrous DMOS per mg of antibody. Incubate at room temperature for lh.
Remove unbound biotin in the same manner as for FITC (see Supporting Scheme 1).

Option 1 Immunofluorescence of intracellular antigens in unfixed cells Additional material 含 有 0 . 3 % 和 0. 1 % (m /V ) 的 Saponin-P B S : 在棕色瓶中储存， 4°C 0 含有〇• 3 % 的 Saponin 和 lOjug/ml PI 或 20Mg/ml 的 7- A A D 的 PBS (推荐使用）：临 用前加入P I 或 7-A A D 储存液至合适浓度；避光保存。 1 . 将 约 2 乂 1 0 6个细胞置于12111111\15111111试管，补 充 1〜 21111?83。 4°〇， 300呈离心 5min。弃上清，再 用 l〜2m l P B S 洗一遍。 4°C ， 300g 离 心 5mirl。弃上清，轻弹试 管底使细胞沉淀分散开。 如 果 有 相 当 数 量 的 死 细 胞 存 在 ， 在 渗 透 前 应 该 用 Ficoll-Hypaque分 离 去 除 死 细 胞 ， 或 者 用 焚 光 染 料 标 记 死 细 胞 ，在 流 式 分 析 时 排 除 这 部 分 细 胞 。 2 . 用 0 . 3 % 的 Saponin-P B S 稀释荧光标记的抗体置合适的工作浓度。取 IOOm I 加入到细 胞中。振荡混匀。 4°C 孵 育 30min (孵育条件根据抗体特点可以适当改变）。 3•加入2m l P B S ， 4°C ， 300g 离 心 5m i n 。 弃 上 清 ，细 胞 沉 淀 再 用 含 有 0 . 1 % SaponinP B S 洗一遍。 4°C ， 300g 离 心 5m i n ， 弃上清。如果细胞采用荧光标记的一抗直接标 记 ，根据需要直接进行步骤5a 或 5b 。 4 . 如果采用的是间接标记，在 步 骤 2 和 3 标记一抗或者生物素偶联的一抗后，需要对 荧光素标记的二抗或者荧光素标记的亲和素再进行二次标记，标记程序如步骤2 和 3 , 只是将标记的抗体换成荧光素标记的二抗或荧光素标记的亲和素。 5a. 如果不同时进行D N A 含量分析：重 悬 细 胞 于 P B S ，浓 度 控 制 在 I X l O 6〜2 X 106个 细胞Anl (不要使用0 . 3 % Sap〇nin-P B S ) ; 有必要的话，用尼龙网过滤细胞去除细胞 团块。样品保存在4°C ，避光条件，直到上机。 5b. 如 果 同 时 进 行 D N A 含 量 分 析 ，重 悬 细 胞 于 0 . 3 % 的 Saponin和 IOfXgAnl F [或
20网 /1111的 7-八 八 〇 的 ？ 8 8 ， 浓 度 控 制 在 1 父 106 〜 2 \ 1 0 6 个 细 胞 /1111， 4 < > (：孵 育 lOmin。样品保存在4°C ，避光条件，直到上机。有必要的话，用尼龙网过滤细胞去 除细胞团块
Option 2 Labeling of dead cells with 7-aminoactinomycin D (7-A A D ) Additional material 20网 /1111的 7-八 八 〇 的 ？ 8 8 ， 浓 度 控 制 在 1 父 106 〜 2 \ 1 0 6 个 细 胞 /1111， 4 < > (：孵 育 lOmin。样品保存在4°C ，避光条件，直到上机。有必要的话，用尼龙网过滤细胞去 除细胞团块


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Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments

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Cite this article

Aladdin Scientific. "Immunofluorescence and cell separation" Aladdin Knowledge Base, updated Dec 24, 2024. https://www.aladdinsci.com/us_en/faqs/immunofluorescence-and-cell-separation-en.html
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