Protocols

Intrauterine microelectroporation for efficient gene transfer in mouse embryos

Summary

The introduction of genes into the embryo has been successfully achieved by a new technique of electroporation of the chicken embryo. In contrast, since the mammalian embryo is enclosed by the mother's uterus, genetic manipulation of the mammalian embryo in a specific region of the uterus during most stages of development has been difficult, if not impossible, using traditional methods. To address this difficulty, we have developed the intrauterine micro-electroporation technique, which uses fine tungsten and platinum wires placed into the cerebral ventricle of the mouse embryo to introduce DNA into the mouse embryo. This transient effect on brain development was detected from the embryonic stage to maturity, although the ectopic expression of the gene lasted only a few days. Author: T. Friedman et al, Translator: Jingwei et al. This experiment is from "Gene Transfer".

Operation method

Electroporation of mouse embryos in utero

Move

Electroporation of mouse embryos in utero Materials

reagents
DNA, solution to be introduced (l ug/ul)

Ethanol (50 %)

Solid green F C F protein staining reagent (Sigm a-A ld rich )

Phosphate Buffer (P B S)

Pregnant mice (E 10.5 or longer)

Sodium pentobarbital

Instrumentation

Stainless steel small surgical clips
电 极 将装在塑料管中连接有金属针(W P I 5428)上 的 钨 丝 和 铂 丝 (A -M 系统)用 砂 纸 磨 尖 (图 1B ) 制备电极。电极用一薄层绝缘漆抛光,待抛光漆干了以后,用丙酮浸泡的棉花刷将金 属 针 从 尖 端 (约 200Mm ) 移去。 光 纤 光 源 (Leica) 手 术 镊 (R O B O Z ) 玻 璃 毛 细 管 (Stoelting公 司 ) 拉长并用镊子固定尖端(图 1A )。 微 操 作 器 (micromanipulator) ( K D scientific) 微 吸 液 器 (micropipette) 脉 冲 发 生 器 (M o d e l 2100, A -M 系 统 ) 手 术 剪 (R O B O Z ) 缝 合 线 (3-0, D e x o n I I ) 图 I. A •用于注射的玻璃毛细管的形状,通过微量吸液管拉长而成,尖端外径约为2C V m 。为防止伤 害子宫,离 尖 端 1_处 的 外 径 应 不 超 过 5 0 ^ 。 R 钨丝和铂丝用砂纸磨尖,并用一薄层绝缘漆抛光。 方法 1 . 腹腔内注射戊巴比妥钠(50fxg/g 体重)麻 醉 孕 鼠 (E 1 0 . 5 或孕期更长)。 5 〜 IOmin 后 ,用剃须刀的刀刃刮去小鼠腹部的毛,并 用 5 0 % 乙醇洗涤。 2 . 在腹腔剪一个2. 5c m 或更短的小口,用镊子小心取出子宫角,把其放在P B S 浸润的 棉纱上, 然后把它们放在伤口周 围 。 用 P B S 维持子宫的湿度很重要。 3. 用光纤光观察胚胎。用 温 热 的 P B S (37°C ) 浸湿光纤末端和子宫角。用食指和 中指固定住光纤,将子宫放在拇指和光纤之伺。轻轻挤压子宫,使胚胎靠近子 宫 壁 (图 2)。 用 P B S 浸润的棉花刷摩擦子宫表面可将胚胎转到位。 4•用浓度为l%的固绿蛋白质染液配制 l(! x l D N A (lM g/fxl) 5 . 胚胎到位以后,用微操作器将D N A -固绿染料混合液注入侧脑室内。 6•将钨阴极和钴阳极插入到子宫中,使祀区域在两个电极之间(图 2)。在 I s 间隔内连 续用脉冲发射器施加三方波电流脉冲(7〜10V , 100 m s ) 3 次。 注意手术时间越短,存活率越高。每只孕鼠最长手术时间为30min。
图 2. A . 在食指和中指间固定光纤。 B. 将子宫角放在光源和拇指之间。按压子宫使胚胎到达靠 近膜的位置。 C . 注 射 l/xl D N A 溶液到脑室。 D . 将钨负电极和铂正电极分别插人到左右两个半 球 ,然后输人一系列三方波电流脉冲。 E •不同电穿孔中两个电极的位置。 7.将子宫角放回原处,加人少量P BS (约5(%1)。缝合子宫壁上的手术切口,并 用 9m m 的小手术夹闭合皮肤。在小鼠从麻醉作用中清醒之前(约 2h ) 保持小鼠的温度。 胚胎的存活率以及细胞转染效率依胚胎和电穿孔位置不同而各异。在 E 11.5 进行电穿孔, 有 6 0 % 的胚胎存活,存活的胚胎中5 0 % 显示出电穿孔成功。依赖于胚胎所处发育阶段,以 及电穿孔的区域对实验条件优化十分必要。


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Categories: Protocols
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Da — when not otherwise indicated, molecular weight units are daltons.   Mw — weight-average molecular weight.   Mn — number-average molecular weight.

Products are supplied for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.

Cite this article

Aladdin Scientific. "Intrauterine microelectroporation for efficient gene transfer in mouse embryos" Aladdin Knowledge Base, updated Dec 24, 2024. https://www.aladdinsci.com/us_en/faqs/intrauterine-microelectroporation-for-ef-en.html
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