🌎 Ship to: United States
Toggle Nav
Cart
Search
Same-day shipping on all in-stock items.
Advanced Search
Quick Order SDS CoA
Menu
Account
Settings
྾
224,000+ research products · Triple ISO certified · COA & SDS available for every product · Same-day shipping on in-stock items
Protocols

Cloning and Expansion of Human T Cells

· Reviewed · Published · Updated · 8 min read
Summary

Induction of antigen-specific T cells

Author: J.E. Colligan et al, Translated by Xuitao Cao et al. This experiment is from "Comprehensive Immunology Laboratory Guide".

Operation method

Cloning and Expansion of Human T Cells

Move

Basic Programmes Compact Immunology Laboratory Guidelines, Chapter Materials

When soluble antigen is used to induce specific autologous T cell clones:
Peripheral blood mononuclear cells (P B M C ; unit 8.1), derived from individuals sensitized to antigen, serve as response cells

Antigen to be tested (antigen or antigenic peptide)

Irradiated inactivated autologous or H L A-matched allogeneic P B M C, used as antigen-presenting cells
E B V-transformed autologous B cells (E B V-B cells; cell 8.16), used as antigen-presenting cells for known antigens

specific allogeneic T cells when cloned:

P B M C , from healthy volunteers, as response cells

irradiated inactivated allogeneic P B M C or allogeneic E B V -B cells, as stimulus cells

T cell culture medium
3H T d R (推荐使用） V P B S (无 C a 2+ 及 M g 2+ ; 推荐使用） 0 . 0 5 % ( V / V ) 戊二醛， P B S 配制 24 孔 细 胞 培 养 板 （Linbro; H a m p t o n Research) 96 孔圆底细胞培养板 （Becton Dickinson Labware) 15ml 和 50ml 离 心 管 （Becton Dickinson Labware) la• 诱 导 特 异 性 自 体 T 细 胞 时 ： Ficoll-Hypaque密 度 梯 度 离 心 法 分 离 P B M C (单元 8.1)，在 2 4 孔细胞培养板中加入IO6 P B M C , 然后加入不同浓度的抗原肽或可溶性 抗 原 （〇. 1〜lO^g/ml) ，培养基总体积lml。 l b . 诱导 特 异 性 同 种 异 体 T 细胞时：用 IO6照 射 灭 活 （4 0 G y ) 的 同 种 异 体 P B M C 或 2 X 105照 射 灭 活 （5 0 G y ) 的同种异体E B V - B 细 胞 刺 激 IO6 P B M C (反应细胞）。 其 中，刺激细胞与反应细胞的H L A I类 或 H L A II类 抗 原 （分 别 用 于 C D 8 + 或 C D 4 + T 细胞的克隆）应不相容。 2 . 细 胞 置 37°C ， 5 % C〇 2细胞培养箱中培养10d ， 其间不需补充培养基和生长因子。 3 . 推荐操作：可在培养第5 天 各 取 100M1细胞悬液加入9 6 孔培养板中，评 估 反 应 性 T 细胞的增殖能力，每 组 设 2〜3 复孔。加 入 1/xCi (37kBq)3H T d R ，掺 入 4h 后 ，用 7 液闪仪检测cpm值 （单 元 8. 8) 。 检测特异性同种异体T 细胞的杀伤活性时，应采 用51C r 释 放 法 （单 元 8. 14)。 4 . 培养 第 1 0 天 ，收 集 细 胞 （应全部为T 细胞），然 后 洗 涤 并 计 数 （附 录 3 A )。 5 a . 特异性自体T 细胞：在 2 4 孔细胞培养板中，加 入 IO6上 述 激 活 的 T 细胞，再加入 适当浓度的抗原或抗原肽进行二次刺激，此时应同时加入IO6照 射 灭 活 （40G y ) 的 自体P B M C 或 E B V - B 细胞，培养基总体积lml。 5b. 特异性同种异体T 细胞：用 IO6照 射 灭 活 （40G y ) 的同种异体P B M C 或 E B V -B 细 胞 （50G y ) ，对 IO6 T 细胞进行二次刺激，细胞培养条件同初次刺激（步 骤 lb)。 E B V - B 细 胞 表 达 高 水 平 的 H L A I 类 或 H L A II类 抗 原 ，此 细 胞 非 常 适 合 用 于 抗 原 肽 的 呈 递 ；但 是 呈 递 原 始 抗 原 的 能 力 较 差 。 E B V - B 细 胞 也 可 用 戌 二 醛 固 定 ，方 法 如 下 ：对 于 可 溶 性 抗 原 ，将 E B V - B 细胞 与 1〜10M g / m l 抗 原 肽 预 孵 育 4 〜2 4 h 。 P B S 洗 涤 细 胞 2 遍 ，然 后 在 1 5 m l 离心管中 将 IO7个 细 胞 重 悬 于 Iml P B S 中。加 入 Iml 0 . 0 5 % 戌 二 醛 （P B S 配 制 ）， 室 温 固 定 30s。 加 入 2 m l P B S ， 孵 育 10min。 P B S 洗 涤 细 胞 2 遍 ， 然 后 用 培 养 基 洗 涤 1 遍即 可 。对 于 同 种 异 体 抗 原 ，戌 二 醛 固 定 的 E B V - B 细 胞 不 需 用 抗 原 肽 预 处 理 。 6 . 二次刺激后5〜7d 收集细胞，用培养基将细胞洗涤1 遍 ，然后计数。按 步 骤 2 培养 细胞并进行下一轮刺激，或者直接进行T 细 胞 克 隆 （见辅助方案1 ; 图 8. 15.1)。

Basic Scheme 2 Induction of T h l or Th2 cells Materials

Human arterial blood or freshly isolated PBMC (Module 8.1)

Antibodies (if required): anti-C D 8, anti-C D 14, anti-C D 20, anti-C D 56, anti-hemoglobin and/or anti-CD 5
图 8 . 1 5 . 1 抗 原 特 异 性T 细胞的诱导。 MNC，单 个 核 细 胞 ； PBMC, 外 周血单个核细胞。 C D 45R O + 单抗 DNase (推荐使用） 小 鼠 纤 维 母 细 胞 （L 细胞）： C D 32 (FcyRII)、 C D 5 8 和 C D 8 0 c D N A 共转染后，照 射 灭 活 （40G y ) I M D M ，含 1 0 % F B S ， 0. lMm 滤器过滤除菌 抗 C D 3 单抗及抗C D 2 8 单 抗 （O K T -3、 U C H T -1、 9.3、 L 293或类似抗体） 诱导Thl 细胞时： rIL-2、 rIL-12 (Pepro Tech， R & D Systems) 及抗 IL-4 中和抗 体 （R & D Systems， Pharmingen) 诱导T h 2 细胞时： rIL-2、 rIL-4 (PeproTech， R & DSystems)、抗 IL-12 中和抗体 及抗 IFN-7 中 和 抗 体 （R & D Systems， Pharmingen)
50m l肝 素 抗 凝 管 （用于收集脐带血） 2 4 孔细胞培养板 1 . 将人脐带血加入到50m l肝素抗凝管中， Ficoll-Hypaque密度梯度法离心分离单个核 细 胞 （ mononuclear cell， MNC) (单元8.1)。 或 者 ，采用新鲜分离的PBMC。 磁珠 法阴性分离脐带血CD4+ T 细胞或者外周血CD4 + 、 CD45R A + T 细 胞 ，所用抗体为 抗 CD8 、 抗 CD1 4 、 抗 CD2 0 和 抗 ⑶ 5 6 单 克 隆 抗 体 （一般情况下， IO6个细胞需用 Ifjtg抗体，单 元 8, 3 ) 。 用抗血型糖蛋白单抗去除M N C 中的红细胞。外 周 血 PBMC 分 离 CD4 + 、 CD45R A + T 细胞时，还应加入抗CD45RO+ 单克隆抗体。脐带血CD4+ T 细胞若需4 °C储存过夜，应 加 入 l ^ g/mlDNase。 2 . 在 2 4 孔细胞培养板中加入5 X 103照 射 灭 活 的 （40G y ) 且 表 达 C D 32、 C D 5 8 和 C D 80 的 L 细 胞 （L 细 胞 用 1 0 % FB S ^ M D M 培 养 ）。再 加 入 抗 C D 3 抗 体 使 终 浓 度 为 1/xg/ml， 置 37T：， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养2〜3h 。 3 . 吸弃悬浮细胞，贴壁细胞用0.5ml 1 0 % F B S^M D M 洗涤一次。如下所示，加 入 IO5 脐带血 CD4+ T 细 胞 或 CD4+ 、 CD45R A + T 细胞及相应的细胞因子及中和性抗体， 培养基终体积为lml。 a•诱导T h l 细胞时：加入相应终浓度的10ng/mlrIL-2、 lng/m U I L -12和 lO^g/ml 抗 IL- 4 中和抗体。 b•诱导 T h 2 细胞时：加入相应终浓度的 10ng/ml rIL-2、 20ng/ml rIL-4、 10/xg/ml 抗 IL-1 2 中和抗体及10Mg/m l 抗 IFN- 7 中和抗体。 4. 3d 后 ，加 入 0.5m l含 4ng/m lrIL- 2 的培养基。以后根据细胞生长情况，用含4ng/ml rIL- 2 的培养基传代。 5 . 培养第 6 天 ，收集细胞，用 1 0 % FBS/IM DM 洗涤细胞一次后，进 行 二 次 刺 激 （步骤 2〜 4)0 6 . 二次刺激后第6 天 ，收集细胞，检测上清中细胞因子分泌谱。方法如下：在包被有 抗 CD3 单抗和抗CD2 8 单 抗 的 2 4 孔 板 中 加 入 IO6个 细 胞 ，再 加 入 终 浓 度 为 2ng/ml 的 rIL- 2 , 培养基总体积1ml。 24〜48h 后收集细胞培养上清， E L ISA 检测上清中细 胞 因 子 的 水 平 （单 元 8. 10)。 胞 内 染 色 （单 元 5. 8 ) 和 ELISPOT检 测 （单 元 8. 11) 时，将 2 4 孔细胞培养板190g 离 心 2min，继续培养6h 后收集细胞。 ELISPOT检测 时 ，轻轻收集细胞，加 到 硝 酸 纤 维 素 孔 中 培 养 18h 。佛波酯和钙离子载体不影响 TCR/CD3 受体复合物介导的细胞活化，可 诱 导 分 泌 ThO样细胞因子谱，因此可作 为对照刺激。 细 胞 在 第 1 轮 刺 激 后 扩 增 10〜2 0 倍 ，在 第 2 轮 刺 激 后 扩 增 6〜 1 0 倍 。通 常 ，第 3 轮 刺 激 并 不 能 诱 导 细 胞 继 续 扩 增 。 在 rIL- 1 2 存 在 的 条 件 下 ，第 1 轮 刺 激 后 ，初 始 型 CD4+ T 细 胞 迅 速 分 化 为 分 泌 IFN- 7 的 T h l 细 胞 。在 rIL-4 存 在 的 条 件 下 ，细 胞 至 少 需 经 过 两 轮 刺 激 才 能 有 效 诱 导 Th2 细 胞 。 二 轮 刺 激 后 ， T h l 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子 水 平 为 ： IFN-y ， 3 〜 5ng/ (111卜106个 细 胞 ）； 1112细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子 水 平 为 ： 11>-4， <311§/(111undefined106 个细 胞 ）； IL-5， < 3 ng/(ml> 1 0 6 个 细 胞 ） • ， IL-1 0 ， 50ng/(m undefined 1 0 6 个 细 胞 ）


For more product details, please visit Aladdin Scientific website.

https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments

Da — when not otherwise indicated, molecular weight units are daltons.   Mw — weight-average molecular weight.   Mn — number-average molecular weight.

Products are supplied for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.

Cite this article

Aladdin Scientific. "Cloning and Expansion of Human T Cells" Aladdin Knowledge Base, updated Dec 24, 2024. https://www.aladdinsci.com/us_en/faqs/cloning-and-expansion-of-human-t-cells-en.html
Was this article helpful? Yes No 0 out found this helpful
We use cookies to ensure the website functions properly and, where permitted, to improve your experience. You can manage your preferences at any time in Settings. Learn more in our Cookie Policy.

Shall we send you a message when we have discounts available?

Remind me later

Thank you! Please check your email inbox to confirm.

Oops! Notifications are disabled.

Privacy Policy Terms of Use Cookie Policy Terms and Conditions of Sale Sales Policy
Products are supplied to verified businesses, institutions, and qualified professionals for research and development use only. Not for use in humans, animals, diagnosis, or therapy.
Copyright © 2023–present Aladdin Scientific Corp. All rights reserved.