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Protocols

B Early events in lymphocyte activation

· Reviewed · Published · Updated · 8 min read
Summary

Author: J.E. Colligan et al, Translator: Xuitao Cao et al, This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".

Operation method

B Early events in lymphocyte activation

Move

Basic Scheme I BCR-induced intracellular calcium changes in B cells Materials 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 7 〇 ^ 溶 液 ， 4°〇 V Hanks 平 衡 盐 溶 液 （HBSS) / 5 % (V /V ) FBS V 含 1 0 % (V /V ) FBS 的 IF12 或 R P M I 培养基 D M S O ，无水的 INDO-1 A M (也写作 Indo-I ， Molecular Probes) FITC-抗 B220 (Sigma 或 BD PharMingen) 生物素化抗B C R 和 抗 C D 19 (可选） V H B S S , 4°C L Ommol/L 伊 屋 霉 素 （ionomycin) ----译 者 注 （Calbiochem) F (ab’ ）2抗 IgM (ju 链 特 异 性 ； ICN Biomedicals) 或抗 IgD (BD PharminGen 或 Southern Biotechnology) 不含钙的培养基和I.〇mmol/L CaCl2 (可选） 12m m X 75m m 适合指定流式细胞仪的带盖的流式管 流 式 细 胞 仪 （即 B D PharMingen F A C S Vantage、 Beckman-Cowlter Cytomics F C - 500或 EPICS、 Cytomation M o -Flo或者含有能激发紫外光区的Indo-I 与可见 光 区 的 F T T C 和 P E 的激光器的任何仪器） 1 . 按 单 元 2.1所述方法制备小鼠脾细胞。每 个 脾 加 入 5m l 冰 冷 G e y 溶液于冰上处理脾 细 胞 3m i n 来裂解红细胞。 2•用5ml H B S S / 5 % F B S 漂洗细胞3 次 。用 含 1 0 % F B S 的 R P M I 或 IF1 2 培养基重悬 细胞至终浓度为IO X lO 6 个细胞/ml (任一液体可以用于整个检测）。如果需要，小 量静息的B 细胞可通过经Percoll梯度液分离纯化B 细 胞 （C P I 单 元 3. 4 ) 之后采用 抗 T 细 胞 抗 体 及 补 体 （单 元 2. 5 ) 或采用磁珠去除T 细胞来进一步纯化（可选）。 3•在50Mg INDO-I A M 加 入 5〇 4 D M S O 制 备 新 鲜 的 In d o -I溶液。通过预实验检测荷 载 1 0 0 % 细 胞 而 不 影 响 细 胞 活 力 所 需 要 的 量 ，来 确 定 其 最 佳 使 用 浓 度 （如 2 〜 10]umol/L )0 4 . 采用最佳浓度的In d o -I荷 载 B 细 胞 ，在适用流式细胞仪的带盖的12m m X 75m m 管 子 中 将 5jul In d o -I与 IO X lO 6 个细胞混合成总体积lm l。 松盖 在 37°C孵 育 30m in。
5 . 将 荷 载 Indo-I 的细胞转移到一个冰槽中。按 每 I.O X lO 6 个 B 细 胞 加 入 1.0/xg FITC- 抗-B 220 (或与藻红蛋白偶联的C D 5、 C D 2 3 或 C D 2 抗体）。在冰上孵育30min，然后 用 冷 H B S S 漂洗。用 含 1 0 % F B S 的 冷 IF1 2 重悬。保持细胞在冰上直到使用。如果 想要更强的钙信号，在设置了 F A C S 的 基 准 后 （步 骤 9)，加入生物素化的抗B C R 和 C D 19抗 体 和 5 倍的亲和素。 6 . 在 37C 水浴中加温30m l 含 1 0 % F B S 的 IF1 2 培养基。将 Indo-I 荷载的细胞、预温 的培养基，以及水浴锅带到流式细胞仪所在的实验室。 7•将IOOmI 1.0 X IO6 个 细 胞 转 移 到 另 一 个 12mm X 75m m 管 子 并 加 入 0. 9m l 预温的 IF1 2 / 1 0 % FBS。 在 37°C进行热均衡 2min。 8•设定流式细胞仪在350n m 激 发 I n d o -I并 在 405nm (FL2 ) 与 485nm (F L l) 检测荧 光 。计 算 FL2 (钙结合）与 FL l (钙非结合）的比率。 9• 检 测 背 景 紫 色 光 （405n m ) 与 蓝 色 光 （485n m ) 的 比 率 共 lmin，然 后 加 入 2/xl l.Ommol/L 伊屋霉素。将管子涡旋混匀然后检测荧光共4min (荧光值将快速升高并 达到平台期，随后开始下降。） 10. 重复步骤7 并检测背景荧光值lmin。 加 入 50Mg 抗 IgM(|u链特异性）或 抗 IgD，漩 涡混匀，并立即按步骤8 检测荧光比率共5〜8min (荧光值的升高将比使用伊屋霉 素的慢）。 11. 可选：为了区别细胞内钙释放与细胞外钙流入，细胞可釆用无钙培养基重悬以用于 研 究 （F B S 也必须透析以去除任何钙离子）。随后，可 加 入 l.Ommol/L CaCl2来观 察细胞外钙内流。 1 2 . 按 C P IM 单 元 5. 5 中 Rabinovitch的描述计算钙的浓度。
Basic Option 2 Analysis of protein tyrosine phosphorylation Materials (see Appendix 1 for items with V) V 无 血 清 IF1 2 或 R P M I 培 养 基 （单 元 3. 8) 25fxg/ml F (ab')2抗 IgM (/X链特异性； ICN Biomedicals) n/ I X P B S ， p H 7.2，含 有 及 不 含 憐 酸 酶 抑 制 剂 （艮 P 10mmol/L N a F 与 lmmol/L N a 3V O 4) ， 4〇 C V 裂 解 缓 冲 液 （见配方） B C A 蛋白测定试剂（Pierce) V 溶 于 I X T B S 丁 的 1. 5% B S A (见配方） 溶于 1. 5% B S A /1 X T B S T 的 R C 20 : H R P O (BD PharMingen、 Transduction Laboratories) 或 H R P -结合的 4G 10 (Upstate) 抗磷酸酪氨酸抗体 V l X T B S T 溶液 增强化学发光试剂盒（Perkin-Elmer Life Sciences 或 Pierce) 稳定素-P 膜 （Millipore) 染 料 木 黄 酮 （可选） 1 . 如 前 所 述 （单 元 2. 5 中基本方案1 ) 纯化去除红细胞的静息B 细胞。
2 . 于 I.5m l微量离心管内用无血清IF1 2 或 R P M I 培养基重悬细胞至浓度为25 X IO6 个 细胞/m l。 37°C静置孵育 30min。 3• 用 25/x g /m lF (&1/)2 抗 ： ^以 刺 激 静 息 B 细 胞 不 同 的 时 间 （如 0.5m in、 lm in 、 5min 及 15min) ， 刺激过程中细胞保持在37°C 。 加 入 0.5m l冰冷的含磷酸酶抑制剂的I X P B S ， p H 7. 2 终止反应。 4. 4°C ， 10 O OOg离 心 B 细 胞 lmin。用 0.5m l 不含磷酸酶抑制剂的I X P B S 漂 洗 3 次 。 用 0.5m l 裂解缓冲液重悬漂洗过的B 细胞。冰 上 孵 育 30min。于 4°C ， 12 OOOg离心 30m i n 去除裂解液中的核碎片和细胞骨架相关蛋白。 5 . 可选：根据厂家说明采用B C A 蛋白测定试剂检测蛋白质浓度。在 S D S -P A G E 胶不 同泳道中上样等量蛋白质。 6 . 按 单 元 12. 3 所 述 ，在还原条件下于1 0 % SDS-P A G E 胶中分离蛋白质。于 200V 电 压下电泳3h ，并按 单 元 12. 5 所述，在转膜缓冲液中转移到稳定素-P 膜上。 7•室温下在摇床上用I .5 % BSA/ 1 X T B S T 封 闭 膜 20m in。 8 . 室温下在摇床上用1 : 5 0 0 的 溶 于 I .5 % BSA/1 X T B S T 的 RC20 : H R P O 或 H R P - 结 合 的 4G 1 0 抗-磷酸酪氨酸抗体孵育膜40m in。 9 . 用 I X T B S T 漂 洗 膜 3 次 ，每 次 lOmin。最后一次漂洗后，按厂家说明书将膜采用增 强化学发光试剂盒中的化学发光试剂孵育。 10. 将 膜 曝 光 于 放 射 自 显 影 胶 片 数 秒 到 几 分 钟 直 到 在 M O 〜 20k D a 可见清晰的条带 (P L C -7 与 C D 21， 140k D a ; Src 激 酶 ， 50〜56k D a ; Syk 激 酶 ， 70kDa)。刺激过的 细胞将比未刺激的细胞观察到更高强度的一系列条带。 11. 用免疫沉淀方法鉴定蛋白质（单 元 12. 2)。如果需要，可 用 静 息 B 细胞重复实验来 进一步减少背景。同样如果需要， P T K 的作用可通过在木黄酮存在的情况下进行 实验来证实。
BASIC OPTION 3 Analysis of cell size and expression of B-cell activation molecules Materials (see Appendix 1 for items with V) 纯化的静息B 细 胞 （单 元 2. 5) V 含 5 % (V A O F B S 的 IF1 2 或 R P M I培养基 25|LLg/ml F (ab’)2 抗 M (IC N Biomedicals) 、 1.0Mg/m l 抗 CD40 (克隆 1C1D ; Southern Biotechnology 或 eBioscience) 或 I .Opg/ml LPS (Sigma) V F A C S 缓冲液 10/xg/ml 2. 4G 2 抗 Fe 受 体 抗 体 （B D PharMingen 或 A T C C # H B -197) ?1丁0抗鼠-1\/^(： 11类分子化0?1^]\^叫611，义§1 ^ ，或其他公司）：克隆]\110)6 (等位基因特异的）、 14.4.4 (等 位 基 因 特 异 的 ）及 M 5/114. 5. 2 (种属特异 的）， -C D 80 (小鼠特异的）、 -C D 86 (小鼠特异的）或-C D 138 (小鼠特异的）。 V l X PBS (附录 2A ) V 固 定 液 （可选） P E 标记的抗B 220抗 体 （可选）
96、 4 8 或 2 4 孔培养板 1 . 用 含 5 % F B S 的 IF1 2 或 R P M I 培养基培养纯化的静息B 细 胞 （来源于未免疫动物的 全脾细胞或去除T 细胞的脾细胞），细胞密度为 I.O X l O 6 个细胞/m l ，对 96、 4 8 及 2 4 孔培养板体积分别为0 •2m l 、 I.O m l 及 2. 0m l 。 2 . 根据所要分析的实验数目设定9 6 、 4 8 或 2 4 孔培养板的培养复孔为3 孔 。用 25Mg/m l F &1/)2抗 m、 I .0Mg/m l 抗 CD40 或 I .Ojug/ml LPS 刺激 B 细胞。 3 . 培 养 18〜96h 后收集细胞并用F A C S 缓冲液漂洗细胞。 4 . 预留一个含0.2X 106〜1.0X 106 个未标记细胞的样本。分配其余细胞使每管含0.2X 106〜1.0父106 个细胞。在台式离心机上4°(：， 40(^离心5111丨11。弃上清。 5 . 用 IOOm I F A C S 缓冲液重悬细胞，加 入 10Mg/ml 2. 4G 2 抗-F c 受 体 抗 体 （或正常小鼠、 大鼠或人IgG) 4°C 预孵 育 5min。 6 . 无需漂洗，直接加入I.OiUg FITC-抗小鼠- M H C class II (克隆M K D 6, 14. 4. 4 或 M 5/ 112.4)、 -抗 C D 80、 -抗 C D 8 6 或-抗C D 138抗体标记细胞。冰上孵育细胞30minQ 7 . 加入3.〇 1111?八〇 3缓冲液到离心管中， 4°〇， 40(^离心5111丨11。弃 上 清 。重复漂洗一 次 。用 0.5〜1.0ml F A C S 缓冲液重悬细胞。 8 . 可选：用 I X P B S 漂洗一次去除存在的蛋白质，然后固定细胞用于随后的分析。弃 上清，用 0.5m l 固定液重悬细胞。 4°C 可 储 存 1 周 。 9 . 在流式细胞仪上分析细胞（第四章）。采 用 未 标 记 细 胞 （步 骤 4 ) 来检测前向及侧向 散射光。 10. 根据前向及侧向散射光来确定活细胞并分析其F I T C 荧光。 11. 可选：如果需要，用 P E 标记的抗B 220抗体来进一步标记细胞。


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Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments

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Aladdin Scientific. "B Early events in lymphocyte activation" Aladdin Knowledge Base, updated Dec 24, 2024. https://www.aladdinsci.com/us_en/faqs/b-early-events-in-lymphocyte-activation-en.html
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