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Detection of intracellular factors by flow cytometry

posted this at Jun 9, 2025 Updated at Dec 24, 2024
Summary

This unit describes the use of 4-color fluorescence to analyze the levels of IFN-7, IL-4 and IL-2 expressed in CD4+ T cells.

(can be used to calculate T h l and T h 2 cell ratios).

Author: J.E. Colligan et al, Translated by Xuitao Cao et al. This experiment is from the "Compendium of Immunology Laboratory Guidelines".

Operation method

Detection of intracellular factors by flow cytometry

Move

Basic scheme Fluorescent labeling of intracellular factors Materials 经过激活、固定、冻 存 的 细 胞 （见辅助方案1〜3) n/ PBS-S V PBS-S/牛奶 荧光标记的抗细胞因子抗体（直接标记用，如 H T C -偶联的抗IFN- 7 和 PE-偶联的 抗 IL-4; B.D.Bioscience 公司， B. Pharmingen 公 司 ， Caltag， Biosource 公 司） 同型对照 VPBS/BSA 37°C 水浴 突光标记用的4ml V 形 底 试 管 （Sarstedt) I. 37°C 水 浴 复 苏 已 经 活 化 、固 定 的 冻 存 细 胞 。加 入 Iml PBS-S 于 每 个 样 品 ，转移 2 X 106个细胞至4ml V 形底试管
2. 4°C ， 1500g 离心 lOmin。弃上清。 3 . 加 入 50M1 的 PBS-S/牛奶，上下颠倒试管重悬细胞。冰上孵育30miri。 4 . 将细胞分到试管中， 4°C ， 1 5 0 0g 离 心 lOmin。弃上清。 每 4 X 1 0 6个 经 佛 波 醇 豆 葱 酸 乙 酸 盐 （P M A )-离 子 霉 素 （ionom ycin) 活 化 的 细 胞 可 以 分 成 4 〜 8 份 样 品 ，而 一 支 同 样 数 量 的 经 抗 原 活 化 的 细 胞 仅 能 分 成 2 份 样 品 。 5 . 准备抗体混合物，即 用 PBS-S/牛奶 稀 释 到 合 适 浓 度 （每种抗体的浓度通常为0.5〜 2. 5|ug/ml)。加 入 50jul的抗体混合物于每个试管，反复敲打管壁混合细胞。对于每 份样品，制备同型抗体对照。 6 . 避光， 4°C 孵 育 30min。 7 . 加 入 I m l 的 PBS-S 于每个试管，振荡。 4°C ， 1500g 离 心 lOmin。弃上清。敲打管底 弹开细胞。 8 . 重复步骤7 。 9 . 用 300〜600^1的 PBS/B S A 重悬细胞。在 24h 内进行流式细胞仪分析。根据活化的 细胞类型和阳性细胞的期望频率，确定获取的细胞数量。
Adjuvant Programs I PM A and ionomyciii Stimulation of T Cells Materials n/ R P M I -10完全培养基， 37°C 溶于1 0 0 % 乙醇的200Mg/m l 佛波醇豆蔻酸乙酸盐（P M A ) ，保存在一 20°C 。 溶于二 甲 基 亚 砜 （D M S O ) 的 10mmol/L (7. 5m g /m l ) 的 离 子 霉 素 （ionomycin) (Ca2+ 盐），保存在一 2 0 °C 溶于 D M S O 的 10mg/ml 的 BrefeldinA (B F A ) ，保存在一20°C 溶于PBS (见附录 1 ) 的 3mg/ml 的 DNase I (60 OOODomase U /m l ; Calbiochem 公 司）；可选用 4m l 和 15ml V 形底试管 2 4 孔组织培养板 37°C ， 5 % C 0 2培养箱 细胞刮或移液管 1 . 准 备 P B M C (单元8. 1 0 ) 。 如果需要保留一段时间再进行检测，可以放置在 4 °C R P - M I -I O 培养基中过夜，浓 度 在 4 X 10 6〜2 0 X 1 0 6个细胞/m l 。 2 . 重悬细胞于37°C 预 热 的 R P M I -I O 培养基，浓 度 为 4 X 106个细胞/ml。接种细胞于24
孔组织培养板，每 孔 lml。 3 . 每 5m l 的 37°C 预 热 的 R P M I -10培 养 基 中 加 入 Im I 的200网/1111的P M A 、 IiU l 的 10mmol/L 的 ionomycin 和 IOjul 的 10mg/ml 的 B F A 。在 15〜30min 内使用，混勻。 警告：操 作 P M A 、 ionomycin、 B F A 时应戴手套。 4 . 加 入 I m l 的 培 养 基 于 每 孔 （含 浓 度 为 2 X 106个细胞/m l 的细胞， 20ng/m l的 P M A ， ljumol/L 的 ionomycin 和 l 〇 jug/ml 的 BFA)〇 也 可 以 刺 激 2X 107个 细 胞/IOml于 6 孔 板 或 者 4X 105个 细 胞 / 2 0 0 4 于 96 孔 板 。 5 . 于 37°C ， 5 % C 0 2培 养 箱 中 孵 育 6h 。该 培 养 时 间 适 合 于 IL- 4 和 IL- 5 , 对 于 IL-2 和 IFN-7 算是折中。 6•可选择操作：加 入 40jul的 3mg/ml DNase I 于 每 孔 （终 浓 度 为 3500Dornase U /ml) ， 37°C 孵育 5min。 7 . 用细胞刮或者移液管处理贴壁细胞。转 移 细 胞 至 4ml V 形 底 试 管 。上下吹打细胞， 打散细胞团。 8. 4°C ， 300^离 心 lOmin，固 定 细 胞 （见 辅 助 方 案 3)。如果待测的细胞表面标志对多 聚甲醛固定剂敏感，在固定前遵照辅助方案4 进行标记。
Supplementary Scheme 2 Antigen-activated T-cells Materials R P M I -10完全培养基， 37°C 抗 C D 28 (人 ： B D Biosciences L 293 克 隆 、 B D Pharmingen 和 Beckman-CoulterC D 28.2 克隆、 Y T H 913.12 克隆；小鼠 ： BDPharmingen37.51 克隆） lOmg/m l 的热灭活结核菌素， H 37R a 菌 株 （B D Biosciences) 溶于 D M S O 的 10mg/ml 的 BrefeldinA (B F A ) ，保存在一20°C 溶于PBS (见附录 1 ) 的 3mg/ml 的 DNase I (60 OOODornase U /m l ; Calbiochem 公 司）；可选择溶于P B S 的 0. lmol/L 的 E D T A 16m m X 125m m 的聚苯乙燦培养管（Corning公司） 37°C ， 5 % C 0 2培养箱 4m l 聚丙烯或者厚壁聚丙烯V 形底试管 1 . 准 备 P B M C (单 元 8. 10)，重 悬 细 胞 于 37°C 预 热 的 R P M I -I O 完 全 培 养 基 ，浓度为 2 X 106个细胞/m l 。 2 . 加 入 抗 C D 2 8 至终浓度为I iU g A n U 吹打混匀。转 移 2m l 细 胞 于 16m m X 125m m 的圆 底聚苯乙烯组织培养试管。 3 . 加 入 lOmg/m l 的热灭活结核菌素至终浓度10Mg/ml，混匀。最适抗原浓度应预先确定。 4 . 室温， 300^离 心 5min。拧松管帽，直立放置37°C ， 5 % C 0 2培养箱中孵育2h 。 5 . 用 R P M I -I O 完全培养基稀释10m g /m l 的 B F A 至 ZQOjug/ml (1 : 5 0 稀释）。轻轻地
加 入 IOOiUl到 每 支 试 管 （终浓度为10Mg/ml) ，不要扰动细胞沉淀。 37°C 孵 育 4h 。 最 佳 的 终 止 时 间 和 条 件 需 要 预 先 确 定 。 6•可选择操作：加 入 40M1的 3m g /m l D N a s e I 于 每 孔 （终 浓 度 为 3500D 〇m a s e U /ml)， 37°C 孵育 5min。 7 . 加 入 20〇 4的 0. Imol/L E D T A 于每孔，室 温 孵 育 5min。上下吹打贴壁细胞，小心 避免气泡产生。转移细胞至4ml V 形底试管。 8. 4°C ， 300g 离 心 lOmin，固 定 细 胞 （见 辅 助 方 案 3)。如果待测的细胞表面标志对多 聚甲醛固定剂敏感，在固定前遵照辅助方案4 进行标记
Supplementary Programme 3 Fixation and freezing of PBMCs Material 4 % (m A O 多 聚 甲 醛 （P F A ) 活化的P B M C (见辅助方案1 或 2 ) 或者活化的表面标记细胞（见辅助方案4) V P B S , 4°C V P B S /B S A , 4°C 10 % (V /T ) 试剂级 D M S O , 于 P B S ， 4°C 4m l 聚苯乙烯V 形底试管 2m l 冻存管 1 . 溶 化 4 % P F A 于 37°C 水 浴 IOmin。振荡溶解任何可见沉淀。 2 . 转移活化的P B M C 至 4m l 聚 苯 乙 烯 V 形底试管， 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清， 勿扰动细胞沉淀。敲打试管底部，打散细胞团块。 3 . 加 入 I m l 冰 冷 P B S ，振荡混匀。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打试管底部，打 散细胞团块。 4 . 加 入 500/xl的预温的4 % P F A ，室温孵育5min，定时振荡细胞，避免细胞成团。 5•加入2m l 冰 冷 PBS/B S A ，混匀。 4°C ， 1500g•离心5min。弃上清。 6 , 重悬细胞沉淀于0.5m l 的 1 0 % D M S O /P B S 。分 装 4 X 106个细胞至2m l 冻存管。可在 一 80°C 保 存 1〜2 年

Supplementary Scheme 4 Cell Surface Labeling of PBMCs Materials 待标记的活化细胞（见辅助方案1 或 2) V P B S /B S A , 40C P E -Cy5 或 PerCP/C y 5. 5 偶联的抗人 C D 4 单 抗 （Sigma， B D Biosciences， Caltag) 或其他感兴趣的抗细胞因子单抗 V P B S , 4°C 4ml V 形 底 聚 苯 乙 燦 试 管 （Sarstedt) 血细胞计数板 注意：所有清洗和孵育过程在冰上操作以减少细胞内因子的分泌。
1•转移活化细胞至4m l V 形底聚苯乙烯试管， 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打试 管底部，打散细胞沉淀。 2 . 重悬细胞于I m l 的冰冷PBS/B S A 。用血细胞计数板计数细胞。 3•分装4 X 106个细胞至合适数量的4m l V 形底试管。 4°C 、 300g 离 心 lOmin。弃上清。 4 . 准备荧光素偶联的C D 4 单抗于2 0 0 4 的 P B S /B S A ，至期望浓度。单抗放置于冰上。 5 . 加 入 200M1 的单抗于细胞沉淀，反复吹打重悬细胞。避光冰浴20m i n 。 6 . 加 入 Iml的冰冷PBS，温和振荡。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打管底弹开细胞。 7 . 按照辅助方案3 的步骤4〜6 完成清洗和固定
Supplementary Scheme 5 Labeling of cytokines in activated cells with fluorescently labeled anti-cytokine antibodies Additional material 未偶联荧光的和F I T C 偶联的抗IFN-7单抗 未偶联荧光的和P E 偶联的抗IL-4单抗 未偶联荧光的和A P C 偶联的抗IL-2单抗 未偶联荧光无关同型对照抗体（与每种抗细胞因子抗体匹配） 注意：所 有 以 上 抗 体 可 从 B D Biosceinces， B D Pharmingen， Caltag， Biosource， R & D Systems 和 eBiosceince 获得。 1 . 准备并用PBS-S/牛奶封闭 的 细 胞 （见基本方案步骤1〜3)。将细胞分成2 份 25M1体 积 于 2 支 4m l 试管。 4°C ， 1500g 离 心 lOmin。弃上清。 2 . 用 5 0 M 1 PBS-S/牛奶含有 lOO^ g / m l 的未偶联荧光特异性抗IFN-7、抗 IL-4和 抗 IL-2 单抗的混合物重悬细胞。在第二管，用 5 0 M 1 PBS-S/牛 奶 含 有 IOOiU gA n l与每个特异 性细胞因子抗体同型的未标记抗体混合物重悬细胞。 3 . 如果添加单抗使Saponin稀释至<0. 0 6 % ，加入所加抗体1/10体积的10X Saponin。 4. 4°C 孵育 lh。 5 . 在所有管中加入F I T C 标记的抗IFN-7 单 抗 、 P E 标 记 的 抗 IL-4单 抗 和 A P C 标记的 抗 IL-2单抗至合适浓度。 4°C避光孵育30m i n 。 6 . 清洗和进行流式细胞仪分析见基本方案步骤7〜9。


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https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
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