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Isolation of mouse natural killer cells from mouse spleen

posted this at Jun 9, 2025 Updated at Dec 24, 2024
Summary

Author: J.E. Collier et al, Translated by Xuedao Cao et al. This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".

Operation method

Isolation of mouse natural killer cells from mouse spleen

Move

basic program 由于所用M A b 只能检测C 57B L 背景小鼠体内的N K 1. 1+C D 3- N K 细胞，故本方 案适用于C 57B L / 6 或 者 C 57B L /10 (以 及 H 2b、 d、q同系小鼠）小鼠脾脏细胞。 清除杂细胞所用的单克隆抗体的活性对本方案至关重要。单克隆抗体可以买到，并 且其杂交瘤可以从A T C C 得 到 ，因此建议检测单克隆抗体的活性以保证实验成功。最 佳补体和细胞浓度也需要通过实验确定。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) C 57B L /6 或者 C 57B L /10 小鼠 V T r i ^ N H 4C l 裂解缓冲液 V H B S S / 3 % (W V ) FBS 10 X 单克隆抗体储存液
G K 1.5 ( A T C C 号 TIB207 )、 53-6.72 ( TIB105)、 M 5/114. 15.2 ( TIB120)、 Jlld 2 (TIB183; PharMingen; 单克隆抗体配方见附录1) 单克隆抗体M A R 18. 5 (TIB216; PharMingen) 浓 度 lmg/ml (单克隆抗体配方见 附 录 1) V 含酚红的 H B S S (Life Technologies) /10% (V /V ) FBS V 低 Tox-M 兔补体，无菌复溶 淋巴细胞M 密度梯度分离液（Accurate Chemical and Sciendfic)，室温 V R P M I - I O 完全培养基 F F T C 标记的抗C D 3 抗 体 和 P E 标记的P K 136抗 体 （Pharmingen) 50m l 和 15m l 带盖聚丙烯锥底离心管 Beckman C S -6R 离 心 机 （或同类离心机） 血清学吸管 注 ：如果细胞用于继续培养，所有试剂和材料必须保证无菌。 1 . 处死小鼠，无菌取脾脏。 2 . 制 备 脾 脏 细 胞 悬 液 （单 元 2.1)，置 于 50m l 离心管中，避免将纤维性杂质移入离心 管 。 200g 离 心 5m i n 以 洗 涤 细 胞 。采 用 单 元 2 . 1 的 方 法 裂 解 红 细 胞 ，或使用 T W N H 4C l 裂解缓冲液。每个脾脏的细胞用Iml H B S S / 3 % F B S 混悬。 3 . 用台盼蓝拒染法计数活细胞（附 录 3C )。用 H B S S / 3 % F B S 混 悬细胞至5 X 107 个细 胞/ml。置于冰上保存。 4 . 制备下述单克隆抗体的I O X 混 合 溶 液 （10X 每种抗体的饱和浓度）： G K 1.5 (抗 C D 4) 35-6.72 (抗 C D 8) M 5/114. 15. 2 (抗 I-A 和 I-E d’k) Jlld.2 (抗 C D 24) 5 . 每 0.9m l 细胞悬液加入0.1m l 单克隆抗体混合液， 4°C孵 育 30min。 6 . 用 冰 的 H B S S / 3 % F B S 洗 细 胞 2 遍 ， 4°C ， 200g 离 心 5min，弃上清。用 IOml冰的 H B S S / 3 % F B S 混悬细胞再洗一遍。将 细 胞 用 H B S S / 1 0 % F B S 混悬至浓度为5 X 107 个细胞/m l 。 7 . 加 入 10Mg/m l 抗 大 鼠 ic (M A R 18.5; lmg/m l 储存液）和 低 Tox-M 兔补体至细胞悬 液 使 其 达 到 最 佳 终 浓 度 （通 常 1 : 6 , 但需要根据经验确定）。 37°C 孵 育 45min，每 15m i n 振摇一次。 8•用 H B S S /10% F B S 洗 一 遍 （步骤 6)。 9 . 用 5m l H B S S / 1 0 % F B S 混悬细胞。取少量细胞悬液采用台盼蓝拒染法计数活细胞 (附录3 0 , 以确定补体裂解效果。 10. 将 5m l 室温的淋巴细胞M 密度梯度分离液加入到一个15m l 离心管中。将 5m l 细胞 悬液轻轻加在分离液上。室温， 200g 离 心 20min，使离心速度缓慢下降。 11. 用吸管从界面小心吸取液体，放 入 另 一 个 15m l 离心管中。必要时可将界面放在白 色背景前以便看清。用 R P M I -I O 完全培养基洗2 遍 （方法同 步 骤 6)。台盼蓝染色 计数活细胞，备用。

12. To test for cellular purity, anti-CD3-FITC and PK136-PE (anti-NK1.1) antibodies at a final concentration of lOug/ml can be added and analyzed by flow-through analysis (Chapter IV).


For more product details, please visit Aladdin Scientific website.

https://www.aladdinsci.com/

Categories: Protocols
Explore topics: Immunological experiments 
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