Labeling experiments with fluorescence in situ hybridization probes for genomic target sequences
Labeling experiments with fluorescence in situ hybridization probes for genomic target sequences
Fluorescence in situ hybridization (FISH) requires nucleic acid probes, including deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), or nucleic acid analogs that are either directly labeled with fluorescein or can be indirectly linked to fluorescein. The specificity of the FISH analysis is made possible by complementary pairing of the probe nucleotide with the nucleotide complement of the target sequence. Nucleic acid-linked fluorescent motifs allow homologous regions in cellular structures to be visualized under a fluorescence microscope. Photographic or electrophotographic images of permanent fluorescent staining can be obtained, and the latter allows quantitative determination of probe fluorescence.
Operation method
Labeling of genomic target sequence fluorescence in situ hybridization probes
Materials and Instruments
Sample DNA to be labeled Fluorescein-labeled dUTP 0. 3mmol L dATP 0. 3mmol L dCTP 0. 3mmol L dGTP 0. 3mmol L dTTP Amine-modified DNA to be labeled Move I. Gap translation For more product details, please visit Aladdin Scientific website.
Notch panning enzyme mixture 10 X notch panning buffer Reaction termination solution Sodium acetate Ethanol TE solution TAE buffer Agarose I X TBE Electrophoresis buffer Ammonium acetate Anhydrous ethanol PBS TBS
Warming Device Sephadex G-50 Centrifuge Columns Small Centrifuge Tubes Microcentrifuge Centrifugal Dryer Micro Pipettes Hot Plate UV Transilluminator Flow Cytometer Centrifuge Columns Ultrasonic Breaker![缺口平移是一种将标记核苷酸掺入到D N A 中的方法，这 些 DNA 可以是孤 立 的 DNA片段或是一个完整克隆[39’ 4°]。该方法利用两种酶的联合作用： DNA 酶 I 在 DNA链上打开缺口形成Y端轻基， DNA聚合酶I 在 Y端羟基上加上核苷 酸 。随 着 DNA 聚合的进行， D NA 聚 合 酶 的 5'— 3'外切核酸酶活性将缺口 5'端 的核苷酸水解。反应进行过程中标记的和未标记核苷酸掺入，各 种 大 小 的 DNA 片段被合成，但 是 没 有 D N A 的净合成。产 生 的 双 链 D N A 片段在杂交前必须 变性。 1 . 制备 0. lmmol/L dTTP 溶液：将 IOOjuL 0. 3mmol/L dTTP 加入到 200PL 无核酸酶的水中。 2 . 制备 0. lmmol/L dNTP 混 合 物 ：将 0.3mmol/L dATP、 0. 3mmol/L dC TP和 0. 3mmol/L dG TP各 IOOjUL混合。多余的核苷酸混合物可在一20°C 或 一80°C保存。 3 . 对 于 每 个 标 记 反 应 ，在 放 置 在 冰 上 的 小 离 心 管 中 加 入 Iyg DNA、 0. 2mmol/L 突 光 基 团 标 记 的 dUTP 2.5/JL、 0. lmmol/L dTTP 5juL、 0. lmmol/L dN TP混 合 物 1(^L 、 10X 缺口平移缓冲液5juL，加 无 核 酸 酶 的 水 到 40斗 （见注 释1)〇 4 . 每个小离心管中加入缺口平移酶混合物IOjuiL 。 5 . 混匀并稍离心。 6 . 在 15°C条件下温育8〜16h 。 7 . 加 入 5JUL反应终止液。 8 . 为了去掉未掺入的核苷酸，加 入 乙 酸 钠 、 125juL无水乙醇， 用 12 000r/m in 的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸 去上清。加入1〇〇 1^70%乙醇，稍振荡，用 15 00(^离心51^11。小心地倒掉上 清或用微量移液器吸去上清（见 注 释 2)。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470377801115826aktrj9gpng_small.jpg)
![随机引物标记是通过所有可能的六聚体、八聚体或九聚体核苷酸与变性的 D NA 复性进行标记的一种方法[41’ 42]。这些小的寡聚核苷酸作为引物，通 过 Klenow 酶催化掺入标记和未标记的核苷酸，使 互 补 DNA链合成。标记物是双链和 单 链 DNA 片段的混合物，因此在杂交前需变性。 1 . 制备1〇父4!^13 混 合 物 : 终浓度为1111111〇 1/1^€ 1八丁？、 1111111〇 1凡〇 1(：丁？、 lmmol/L dGTP、 0. 3mmol/L 荧光基团标记的 dUTP 和 0. 7mmol/L dTTP〇 多 余的核苷酸混合物可在一 2〇°C或一 80°C保存。 2 . 用 20juL无核酸酶的水溶解DNA (最 好 为 400〜500ng，见 注 释 5 和 6)。 3 . 加 入 20juL2.5X 随机引物缓冲溶液。 4 . 在沸腾的水中变性5min，然后快速放在冰上。 5 . 在冰上加入5JUL10X dN TP混合物、 4斗 无 核 酸 酶 的 水 ，使最终的溶液 体 积 为 49juL。 6 . 混匀并稍离心。 7 . 加 入 1/aL Klenow酶混勻，稍离心。 8 . 在 37°C条件下温育1〜6h ，较 长 的 温 育 时间通常会提高产物量（见注释 7)。 9 . 加 入 5P L 反应终止液。 10. 加 入 5&L 3mol/L 乙 酸 钠 、 1 2 5 ^ 无 水 乙 醇 ，用 15 OOOg离 心 20〜](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B14703778450833hvnsquu9npng_small.jpg)
![显微切割或流式分选的染色体经过PCR扩增制备整条染色体的DNA，被认 为是对某条染色体全部涂染的高质量探针的首选途径。对于单个染色体、多色 FISH (M-FISH)[43]或光谱核型分析[44]中 所 有 2 4 条染色体的涂染均是此种情 况 。下面提供的操作程序[45]是简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR) 最原始操作 程序[38]的 修 改 版 本 ，适 于 用 SpectrumOrange™ dUTP 或 SpectrumGreen™ dUTP (Vysislnc.) 扩增染色体DNA。此操作程序稍做修改或不做修改，就可 以用各种其他的标记dU TP扩增染色体DNA。反应涉及的寡核苷酸，其 5'端有 XZioI限制性内切核酸酶酶切位点， 3'端有确定的寡聚六核苷酸序列和中间有一 系列简并核苷酸序列（所有四核苷酸的随机混合） 。从理论上计算表明在整个基 因组中每4k b 就有一个这种确定的六核苷酸序列。在合适条件下，用此序列作 为引物的扩增可绕过特定的3'序 列 ，也许通过一个或更多的简并核苷to 进行退 火提髙稳定性[38]， 5'端特定序列使得该引物在较高的温度退火。在实际应用中， DOP-PCR操作程序开始的几个循环中用低退火温度（低 保 真 PCR) ，然后进行 多个循环的高退火温度（高 保真PCR)，产生随机扩增的DNA混合物。 流式分选的染色体一般通过两轮DOP-PC R 的扩增，其产物在荧光标记的三 磷酸核苷酸存在的条件下进行第三轮扩增而得到标记。虽然缺口平移方法也可以 用于标记进行染色体分析的探针，但获得高质量探针一般不需该步骤。 3. 3.1 D N A 的扩增 一般来说，流式分选的染色体进行重悬并在PCR分析缓冲液中扩增， PCR 条 件 为 ： 95°C 、 5min，然后 9 个 循 环 的 94°C 、 lm in， 30°C 、 1.5min， 72°C 、 3min，升 降 温 时 间 为 2min、 5s ; 接 下 来 进 行 3 5 个 循 环 的 94°C 、 15s ， 62°C 、 15s ， 72°C 、 15s (见 注 释 8〜1 0 ) ; 然 后 进 行 单 独 72°C 延 伸 lOmin，最后保存在 4°C 。 上 述 PCR 产 物 在 IOOyL体系中按照同一 PCR条件进行再扩增。 IOjuL](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A14703778849015c2bfb9xizpng_small.jpg)
![除了用聚合酶掺入标记核苷酸的一步探针标记法，也可以用两步标记程序， 包括：①应用上述聚合酶标记探针程序（见 本 章 3.1〜3. 3 ) 将脂族胺取代基掺 人 探 针 DNA; ② 将 修 饰 的 D NA 与胺活化荧光基团进行连接。两步标记程序使 得任何胺活化荧光基团可以与修饰的DNA进行结合，而不是只用与三磷酸核苷 结合的荧光基团商业化产品。另外，所有聚合酶标记程序可以用同样的三磷酸核 苷-烯丙胺- dU TP，因此单一的聚合酶反应条件就可以用于所有荧光标记，无需 对不同三磷酸核苷荧光基团进行反应条件最优化试验。同时，烯丙胺-dU T P 的 掺入比其他核苷酸的掺入更有效。用两步标记程序对烯丙胺-dU T P 进行标记的 试 剂 盒 现 已 有 售 （ARES标记试剂盒， Molecular Probes, Inc. ， Eugene, OR)。 应用烯丙胺-dU TP代替标记三磷酸核苷，脂族胺通过酶促反应掺入dN A ， 从而可以按照下述步骤与胺活化荧光基团、生物素或半抗原结合。该步骤同样可 以用于通过其他一些化学方法掺入的脂族胺探针的标记[22’ 46]。这包括含有通过 亚 磷 酰 胺 化 学 （核酸化学合成）掺入的脂族胺修饰的碱基，或 3'或 5'胺修饰末 端合成的DNA、 R N A 和 PN A 寡聚体。 1 . 用适当的反应缓冲液溶解胺修饰DNA，最终浓度为0.6〜I .OmL反应缓 冲液中有IOnmol脂族胺。 2 . 在适当的溶剂中溶解胺活化标记化合物，终 浓 度 为 10〜20mmol/L 。 3 . 在胺修饰的D N A 中加入多于5 0 倍 （异硫氰酸）或 100〜200倍 （羟基丁 二酯或氯磺酸）摩尔的胺活化染色剂（见 注 释 12)。 4 . 将反应溶液在室温条件下搅拌过夜。 5 . 利用水或T E 平衡和洗脱的Sephadex 0 2 5 型离心柱，用凝胶渗透层析方 法将探针和未结合的标记物进行分离。标 记 的 探 针 洗 脱 在 已 占 体 积 内 （见注释 13)。 6 . 将标记的探针在4°C或更低的温度条件下保存备用](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377917879t4kientvrhpng_small.jpg)
![Universal Linkage System (ULS®; KREATECH Biotechnology BV，阿姆 斯特丹，荷兰）是用铂染色络合物与鸟嘌呤核苷的N7 残基反应进行标记的方法。 反应使核酸与铂荧光基团之间形成稳定的化学键。依据反应条件， U LS化合物 在较低的程度上也与腺嘌呤形成络合物。该方法已用于DNA (包括质粒，黏粒， 分子质量参考物，在低熔点琼脂糖中的DNA、 BAC、 PAC、 YAC，全染色体文 库 ， DOP-PCR产 物 ，如 卫 星 、着 丝 粒 和 端 粒 D N A 的高度重复序列） 、 RNA、 PNA、寡聚核苷酸和扩增的核酸产物[16’ 47]。在 Molecular Probes公 司 （Eugene， OR) 同样提供U LS试剂和试剂盒。 丨 用 任 何 U LS化合物进行标记的模板大小必须小于lOOObp。大 于 IOOObp的 模板通常会产生大量的点状背景。 PCR产 物 一 般 小 于 lOOObp，因此可直接进行. 标记。下 面 将 要 阐 述 的 两 种 D N A 破碎方法—超 声 破 碎 和 酶 切 均 可 以 用 于 Kreatech 和 Molecular Probes 的操作步骤 〇 Molecular Probes 用 Alexa—ULS 拭剂 时推荐用另一 DNA酶 I 操作程序。操作步骤和相应的试剂是Molecular Probes 提 供 的 U LS标记试剂盒的一部分。 3. 5. I DNA 破 碎 3. 5 . 1 . 1 超声破碎 1 . 用 T E 制 备 DNA溶 液 （20ng/ V L)，最好用至少IOOi^L DNA溶液进行超 声破碎。 2 . 将样品放在冰上，用 一 个 小 的 锥 形 底 塑 料 管 进 行 3 个 循 环 、每次循环 Im in 的超声破碎DNA。选择超声破碎仪的功率水平和工作循环数，尽量使用最 高的功率、尽量少的空泡形成。在破碎前和每个循环之后均将DNA溶液放在冰 上 Im in预冷。在第二个和第三个循环前用微型离心机的最高转速离心DNA溶 液 5s ，使全部溶液落至管底（见 注 释 14)。 3 . 取 部 分 D N A 溶 液 在 1 % 的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA 大小是否合适。 电泳操作步骤参考本章3. 1 的步 骤 10〜14。 4 . 开始进行标记程序。 3. 5 . 1. 2 DNA 酶处理 1 . 制 备 D N A 酶 I 的储存液：用 ImL 5mmol/L 乙酸钠、 lmmol/L CaCl2、 5 0 % 甘 油 pH 5. 2 溶 解 Img D N A 酶 I (大 约 2000U/mg， Roche公 司 ， 目录号 104109)。在加冻干的D NA 酶之前和期间，缓冲液均放置在冰上。上下翻转溶 液直至完全混匀，不能振荡，储存液保存在一 2〇 °C条件下并尽量避免反复冻融。 2 . 用 IX 缺口平移缓冲液稀释DNA酶储存液，稀释比例为1 : 500 (见注释](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377951446ctt7e9wyegpng_small.jpg)
![通过将荧光基团与蛋白质（如抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗体蛋白）结合 制备间接标记FISH 探针的辅助检测试剂。许多种类的由荧光基团标记的抗生物 素 和 抗 体 已 商 品 化 （如 Accurate Chemical and Scientific Co. ， Westbury， NY; Calbiochem， San Diego, CA; Cappel Organon Teknika， Durham, NC; DAKO Corp. ， Carpinteria， CA; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA ； Kirkegaard and Perry Laboratories, West Grove, PA ; Molecular Probes， Inc. ， Eugene, OR; Pierce Chemical Co. ， Rockford， IL； Sigma Chemical Co. ， S t Louis， MO) 标记的蛋白质在实验室制备也相当容易。未标记的抗生物素和 其他抗体均可从上述所列公司获得。 作为辅助检测试剂，选择链霉亲和素多于抗生物素，因为其等电点接近中性 pH ，一般认为可以降低非特异性结合。同样，当整个抗体用于F IS H 时 ，常常 去掉较为疏水的F c 区以降低非特异结合。 F c 区可以通过木瓜蛋白酶消化从抗体 中的抗原结合簇切除，产 生 F ab 颗 粒 （单个结合臂） ，也可以通过胰蛋白酶产生 仍相连接的两个结合臂F (ab')2。 Fab'颗粒可以从F (ab')2 中制备，只是选择性 减少连接两个结合臂的二硫键。制 备 F (aV )2、 F ab 和 Fal/ 抗体片段的方法可以 从文献中找到[48’ 49]。 1 . 用 pH 8. 5〜9. 3 的 50m m ol/L硼酸稀释蛋白质至终浓度为1〜10mg/mL。 2 . 用 DMS0 、二甲基甲酰胺或丙酮溶解要求的荧光基团的N -羟琥珀酸酯衍 生 物 ，终浓度为20mmol/L 。 3 . 在蛋白质溶液中加入足够体积的荧光基团溶液，使荧光基团比蛋白质摩 尔 数 多 1〜2 0 倍 （见 注 释 1 8 和 19)。 4 . 将反应物在室温条件下轻柔摇动2h 进行反应。 5 . 利用 TBS或 PBS平衡和洗脱的SephadexG ^h型离心柱，用凝胶渗透层 析方法将蛋白质和未结合的荧光基团进行分离。标记的蛋白质洗脱在已占体积内 (见注释20)。 6 . 将标记蛋白质保存于4°0备用（见 注释21)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377996448ar44yy3s28png_small.jpg)
