Receptor-mediated activation of phospholipase C (P L C) induces hydrolysis of membrane inositol phospholipids to produce diacylglycerol (D A G) and water-soluble inositol phosphate. Both T-cell and B-cell antigen receptors utilize this signaling mechanism, which may therefore mediate the receptor-induced process of extracellular Ca2+ endocytosis. Author: J.E. Colligan et al, Translated by Xuitao Cao et al. This experiment is from the "Comprehensive Immunology Laboratory Guide".
Operation method
Analysis of inositol phospholipid cycling in gonocyte activation Move Basic Option 1 Analysis of [ 3H ] inositol phosphate by DOWEX ion exchange chromatography Material [ 3 H] InsP samples (see Basic Program, Step 6) and standards 1 % (m/V ) potassium oxalate/2m m ol/LED TA Solvent: 60 : 20 : 23 : 18 : 12 (V7 V /V7 V 7 V ) chloroform/methanol/acetone/acetic acid/water or 45 :35 : 10 chloroform/methanol/4mol/L NH4OH Cells (e.g. tumor cell lines, hybridomas, clones, lectin-stimulated cells) Phosphate-free media (e.g. GIBCO/BRL) containing 10 % (V/V) heat-inactivated fetal calf serum (FCS) dialyzed against HBSS or TBS (Appendix 1) to remove phosphate For more product details, please visit Aladdin Scientific website.![细 胞 （如肿瘤细胞系、杂交瘤、克隆、凝集素刺激的细胞） 添加了 2〜20MCi/ml [3H ] 肌醇的培养基 平衡盐溶液，或类似的盐溶液，或无抗生素的R P M I 1640-10 10〜20mmol/L LiCl (可选） 刺激物 冰预冷的1 0 % (m / \ 0 三 氯 乙 酸 （T C A ) ，或 50 : 100 : I (V A V V ) 氯仿/甲醇/ 浓 H C l 或高氯酸 未标记的 Ins(l，4,5)P 3和 Ins(l，3,4,5)P4 [用于 H P L C 分析 Ins(l，3,4,5)P4] 水饱和乙醚 1 : 100稀释的浓氨水 〇 .5g/m l 道威克斯1-X 8 树 脂 （100〜2 0 0 目；甲酸盐形式； Bio-Rad) 混悬于水 60m m o l /L 甲酸納/5m m o l /L 四硼酸二钠 0. 2mol/L 、 0 •4m o l / L 和 0. 8m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L 甲酸 闪 烁 液 （可与含水样本相容；如 Biosafe II， Research Products) 13m m X I O O m m 玻璃管](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513001651devrzqenjfpng_small.jpg)
![直 径 0. 6c m 的一次性柱子 I. 2 X 106〜2 X 107个细胞/样 本 在 含 有 2〜20/xCi/m l [3H ] 肌醇的培养基中，于 37°C ， 5 % C O 2培养箱中培养72h 。 2•用台式离心机300g 离心洗细胞， 3 遍 ，弃上清，重悬于平衡盐缓冲液中。不可含新 霉素及其类似物。 3•吸取200M1细 胞 悬 液 （2 X 106〜IO7个细胞）至一个微量离心管，于 37°C 培养。加入 刺激物或适当的对照。如果要研究两种细胞发生的相互作用，在检测开始时将细胞 沉淀，以促进细胞之间接触。 4 . 在适当的时间间隔加入I m l 冰预冷的1 0 % T C A 裂解细胞。或 者 ，加 入 50 : 100 : 1 (V /V /V ) 氯仿/甲醇/浓 HCl (如基本方案2 中描述的）或髙氯酸来终止反应。如果 要以 H P L C 来分析 Ins(l ，3,4,5)P4, 则加入未标记的 Ins(l ，4,5)P 3和 Ins(l ，3,4,5) P4各 20/xg。涡旋混勻并冰浴30min。 4°C ， 12 000容微量离心101^11。 5 . 将上清移至玻璃管中。在通风橱内，加 入 I m l 水饱和乙醚用于萃取酸，用巴斯德吸 管吸取上层液体并保留。重复萃取4 或 5 次 。 6. 用 1 : 100稀 释 的 浓 氨 水 （根据不同样本确定用量） 中 和 样 本 （以 p H 试纸确定）， 再 加 入 4m l 水 。以 道 威 克 斯 柱 （步 骤 7〜1 2 ) 或 H P L C (见备选方案）分析样本。在 4°C可保存数日。 7 . 吸 取 I.2m l 的 0. 5g / m l 道威克斯混悬物至直径0 •6c m 的柱中制备纯化柱。首次实 验 ，加 入 [3H ] InsP标准品；否则加入待测样本。 8•用30m l 的 60m m o l / L 甲酸钠/5m m o l / L 四硼酸钠盐洗柱，收集 最 后 I m l 洗脱液用于 闪烁记数。确保放射活性已恢复至洗脱[3H ] 肌醇前的背景水平。 9 . 以 6m l 的 0.2m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L 的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP1，每 份 2m l 洗脱 液 。 如果是用标准品进行的预实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。以 2m l 同样的缓冲液洗柱。 10•以16m l 的 0.4m o l / L 甲酸铵/O.lmol/L的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP2，每 份 2m l 洗脱液。 如果是用标准品进行的预实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。以 6m l 同样的缓冲液洗柱。 11•以IOml的 0. 8m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP3, 每 份 2m l 洗脱液。 如果是用标准品进行的首次实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。 以 6m l 同样的缓冲液洗柱。 12.加 入 16m l 的闪烁液于2m l 的洗脱液中。以液体闪烁计数器检测每分钟的记数，共 记 5min0](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513019335v2tmqu2zu2png_small.jpg)
Option to analyze [ 3H ] inositol phosphate by HPLC method Additional materials
Degassed H PLC grade water
2mol/L ammonium formate adjusted to pH 3.7 with phosphoric acid
![Whatman Partisil 10 SAX 柱 （undefined 46c m X 25c m ， IOym 微粒大小）和填充有 Whatman 薄壳型阴离子交换剂的保护柱 1 . 在分析样本前先在S A X 柱上先确定相关标准品的洗脱方案，如 Ins(l，3,4)P 3 (约 48min)、 Ins(l ，4 ，5)P 3 (约 52min)、 Ins(l ，3 ，4 ，5)P4 (约 78min)0 2• 注 入 [3H ] InsP样 本 至 S A X 柱 。 3 . 全程采用1.2ml/m i n 的流速，以除气的H P L C 级水洗 柱 lOmin。以除 气 的 H P L C 级 水 和 2mol/L 甲 酸 铵 建 立 线 性 梯 度 。使 用 O 〜 0.8m 〇l/L 甲 酸 铵 的 线 性 梯 度 洗 脱 30min，将 InsP1 和 InsP2 洗脱于每份Imi n 的洗脱液中。维 持 0 •8mol/L 甲酸铵的浓 度 18min，洗 脱 Ins(l，3,4)P 3和 Ins(l ，4,5)P3于每份0.5m i n 的洗脱液中。根据线性 梯度增加甲酸铵的洗脱浓度至1.8m d /L ，洗 脱 15min，将 Ins(l ，3,4,5)P4洗脱至每 份 Imi n 的洗脱液中。 4 . 使用完毕后用水洗涤柱子24h ，用 甲 醇 保 存 （沉淀甲酸铵，填满柱子）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513036998kmy8zyfwczpng_small.jpg)
![Whatman Partisil 10 SAX 柱 （undefined 46c m X 25c m ， IOym 微粒大小）和填充有 Whatman 薄壳型阴离子交换剂的保护柱 1 . 在分析样本前先在S A X 柱上先确定相关标准品的洗脱方案，如 Ins(l，3,4)P 3 (约 48min)、 Ins(l ，4 ，5)P 3 (约 52min)、 Ins(l ，3 ，4 ，5)P4 (约 78min)0 2• 注 入 [3H ] InsP样 本 至 S A X 柱 。 3 . 全程采用1.2ml/m i n 的流速，以除气的H P L C 级水洗 柱 lOmin。以除 气 的 H P L C 级 水 和 2mol/L 甲 酸 铵 建 立 线 性 梯 度 。使 用 O 〜 0.8m 〇l/L 甲 酸 铵 的 线 性 梯 度 洗 脱 30min，将 InsP1 和 InsP2 洗脱于每份Imi n 的洗脱液中。维 持 0 •8mol/L 甲酸铵的浓 度 18min，洗 脱 Ins(l，3,4)P 3和 Ins(l ，4,5)P3于每份0.5m i n 的洗脱液中。根据线性 梯度增加甲酸铵的洗脱浓度至1.8m d /L ，洗 脱 15min，将 Ins(l ，3,4,5)P4洗脱至每 份 Imi n 的洗脱液中。 4 . 使用完毕后用水洗涤柱子24h ，用 甲 醇 保 存 （沉淀甲酸铵，填满柱子）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513056960eeanfmzytkpng_small.jpg)
![2 . 将滤纸排列在T L C 缸中，用足够盖住硅胶板底部0.5c m 的溶剂进行平衡> 6 h 。如果 使 用 [3H ] 肌醇标记的样品，则 采 用 45 •• 35 : 1 0 氯仿/甲醇/4m 〇l/L N H 4O H 作为 溶剂系统。 3 . 用 [32P ] 正磷酸盐进行无平衡标记时，以无磷酸盐的培养基/10% F C S 洗细胞并重 悬于此培养基中。用微量离心管分装为每管0.2m l ， 37°C 孵育。加 入 无 载 体 的 [32P ] 正磷酸盐至终浓度0.1〜l.OmCi/m l 。孵 育 3min，然 后 加 入 刺 激 物 （如 果 用 [32P ] 正磷酸盐进行标记，则需溶于不含磷酸的液体中）或稀释液对照。在计时上要精确， 并使用重复的细胞样品（如 3 个重复样品）。如 检 测 [3H ] 肌醇脂类，则用标记培养 基 进 行 刺 激 （推荐）。 4 . 加 人 0.8ml 50 : 1 0 0 : 1 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/H C l来 裂 解 细 胞 （细胞来自本方案步 骤 3 或者基本方案1 的步骤 3 ) 。 5•加入 0.03ml 100mmol/L E D T A ， p H 7. 4 ， 0.1ml 100mmol/L K C 1， 0.15ml 氯 仿 ， 0.15m l 水 ，涡旋混匀几秒钟。微量离心2min，移 去 低 层 相 （含有脂类）。 6 . 向剩余的上层相中加入0.4m l 氯仿，涡旋混勻，微 量 离 心 2min，移去低层相并与步 骤 5 中的低层相混合。在氮气中干燥。如有必要，盖上盖子4°C 存放过夜。 7 . 重新溶解于50M1 2 : 1 氯仿/甲醇中，迅速点样20jul于 硅 胶 板 上 （来 自 步 骤 1)，距离 底 部 Icm (用铅笔做标记）。在每块板上层析PI、 PIP、 PIP2和 P A 标 准 品 （每种2〜 4/xg) 。 室温风干。 8 . 将层析板放置于预平衡的T L C 槽 中 （来 自 步 骤 2)，使 其 高 度 达 到 15cm ( 约 lh)。 100°C干燥 3min。 9 . 在通风橱中用碘蒸气预平衡T L C 缸几分钟。将板子放置在预平衡的T L C 缸 中 3〜 5m i n 使 标 准 品 显 色 （黄色-橙 色 ，会退色）；用铅笔对其进行标记。样 品 中 的 PI (但 不 是 P I P 和 PIP2) 同时显色。 10. 用 Kodak X -O m a t 胶片对板子进行自显影，曝 光 几 小 时 （[3H ] PIP2 需在一 80°C曝 光 达 2 周）。如 果 使 用 [3H ] 肌醇标记的样品，则 在 自 显 影 前 用 E N 3H A N C E 喷洒 层析板，在通风橱中风干过夜。 11. 从层析板上刮下目标脂类，用液体闪烁分光法对放射性进行定量。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513072260ir4fu6i9wtpng_small.jpg)