Author: J.E. Colligan et al, Translator: Xuitao Cao et al, This experiment is from "Compendium Immunology Laboratory Guide".
Operation method
Antiphosphorylated Tyrosine for Impression Detection Move Preparation and analysis of basic protocols for antiphosphotyrosine footprinting tests Materials Primary antibody: lmg/m l 4 G 10 anti-phosphotyrosine monoclonal antibody (UpstateBiotechnology) or similar antibody. For more product details, please visit Aladdin Scientific website.
P B S
50 % (m/V) protein A-agarose suspension (Pharmacia) dissolved in PBS/0. 0 2 % (m/V) sodium azide.
L K B )
Cells to be analyzed
Stimulus
2 X and I X lysates, ice cold
PI/P B S , ice cold
lmmol/L sodium oxybate
I X S D S / Sampling Buffer
Sealing solution
Tris Equilibrium Salt with Tween 20 (T B S T )
Secondary antibody: Alkaline phosphatase (AP)-coupled anti-mouse Ig (Promega or Pierce; l m g/m l stock solution to be analyzed in the presence of
(Promega or Pierce; l m g/m l stock solution diluted at 1:7000 in TBST)
V Developing solution
Combitip Dispenser Tube
Continuous Dispenser
Oscillator platform or orbital rotating platform, 4°C and room temperature
95 to 110°C water bath or equivalent
0.2/x m pore size nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell)
Whatman 3M M filter paper
![1•制备4G 1 0 单抗包被的珠子。使 用 Combitip分液管和连续分液器，加 入 4G 1 0 单抗至 一个1.51111微量离心管的侧壁上， 1.5] ^1/个样本。加入0,51111?83。加入50/11的 5 0 % 蛋 白 A -琼脂糖悬液，用 尖 部 削 掉 1〜2m m 的 Combitip分 液 管 （以及移液器枪 头），以防对琼脂糖珠产生剪切破坏。盖上管盖，置于旋转器上4°C 大 于 lh。 2. 按需要刺激细胞，每个样本总体积<〇 . 5m l 。对于体积< 5 m l 的体系，用等体积的冰 预 冷 2 X 细胞裂解液终止反应，立即涡旋混匀，置于冰上裂解20min (到 2h)。对于 体积> 0 . 5 m l 的体系，加 入 4〜1 0 倍体积的冰预冷PI/P B S 终止反应，短时微量离心 以沉淀细胞，吸去液体，以 IO8个细胞/m l 的浓度用冰预冷I X 裂解液裂解重悬并裂 解细胞沉淀物。 3. 将细胞裂解物转移至另一个离心管， 4°C ，高速离心15min。 4 . 离心细胞裂解液的同时，以 短 时 离 心 方 式 （使离心机达到最高速然后停止）洗涤步 骤 1 中 4G 1 0 单抗包被的珠子。吸弃上清仅留50M1，用移液管加1.25m l 的冰预冷I X 裂解液，以适中的速度直接注入管底部。盖上盖子上下颠倒以使珠子彻底重悬。如 前所述短时离心，吸弃上清，留 25〜50W 液体。 5. 将细胞裂解液加到有4G 1 0 单抗包被珠子的管中， 4°C旋 转 3〜6h 。 6. 制 备 SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶。 7. 4°C ，高速离心珠子，吸弃上清。如步骤4 , 用 I m l 冰预 冷 I X 裂解液洗3 次 ，以 Iml 冰 预 冷 lmmol/L 原钒酸钠洗一次。吸弃珠子表面所有的液体。 8. 加 入 lOOjullXSDS/样本缓冲液，重 悬 并 95〜110°C加 热 5min。上 样 并 电 泳 （如标准 的 7. 5 % 、 I O c m X 20cm 胶 ， 45V 电泳 16h)。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469514721699g4avuamrf9png_small.jpg)
